Disbiosi intestinale nei cani e nei gatti

DISBIOSI INTESTINALE NEI CANI E NEI GATTI

 

DIAGNOSI E INTERPRETAZIONE DELLA DISBIOSI INTESTINALE NEI CANI E NEI GATTI

 

Autore: Jan Suchodolski

PII:           S1090-0233(16)30033-8

DOI:         http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.tvjl.2016.04.011

Reference: YTVJL 4804

Appare in: The Veterinary Journal

Accettato in data: 21-4-2016

Si prega di citare questo articolo come: Jan Suchodolski, “Diagnosi e interpretazione della disbiosi intestinale in cani e gatti”, The Veterinary Journal (2016),

http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.tvjl.2016.04.011.

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Articolo di rassegna

 

DIAGNOSI E INTERPRETAZIONE DELLA DISBIOSI INTESTINALE NEI CANI E NEI GATTI

Jan Suchodolski*

Gastrointestinal Laboratory, Texas A&M University (TAMU), College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, 4474 TAMU, College Station, Texas 77843-4474, USA

* Autore corrispondente. Tel.: +1 979 4580933.

E-mail address: Jsuchodolski@cvm.tamu.edu (J. Suchodolski).

 

In rilievo

  • Il tratto gastrointestinale (GI) ospita un complesso microbiota, che consiste di batteri, funghi, virus e protozoi.
  • I metodi molecolari sono ora le tecniche standard per valutare la disbiosi intestinale nei cani e nei gatti con malattie GI.
  • La perdita del microbiota commensale è associata alla diminuzione degli acidi grassi a catena corta e degli acidi biliari.
  • La disbiosi è un fattore di rischio, che può esacerbare l’infiammazione nei cani e nei gatti geneticamente suscettibili.

 

Riassunto

Il tratto intestinale di cani e gatti ha un microbiota molto complesso, costituito da batteri, funghi, virus e protozoi. Fino a poco tempo fa, la coltura batterica tradizionale era comunemente utilizzata per identificare i batteri presenti nel tratto gastrointestinale, ma è ormai riconosciuto che le tecniche di placcatura standard non hanno una risoluzione sufficiente per poter identificare i batteri, soprattutto anaerobi, che si trovano all’interno dell’intestino.

Sono stati ora stabiliti dei metodi molecolari, per valutare la disbiosi intestinale nei cani e nei gatti con malattie gastrointestinali, ma questi approcci non sono ancora ampiamente disponibili per una diagnosi di routine. La perdita del normale microbiota batterico commensale (cioè Lachnospiraceae, Ruminococcaceae e Faecalibacterium spp.), nelle malattie intestinali acute e croniche, è stata legata ai cambiamenti metabolici, ad esempio alle alterazioni nei metaboliti batterici immunomodulatori, come gli acidi grassi a catena corta e gli acidi biliari secondari.

Ciò evidenzia l’importanza della disbiosi nella fisiopatologia delle malattie gastrointestinali.

Attualmente, sono in corso: lo sviluppo di saggi su base molecolare per specifici gruppi batterici, i calcoli degli indici della disbiosi microbica e i saggi per i metaboliti funzionali microbici, per aiutare a valutare la disbiosi.

Questi forniranno una migliore comprensione della fisiopatologia delle malattie gastrointestinali, e possono anche portare a nuovi approcci diagnostici e terapeutici, per la disbiosi.

 

Parole chiave: Canino; Felino; Acidi biliari; Disbiosi; Microbioma; Microbiota

 

Introduzione

Il microbiota intestinale è il consorzio di tutti i microrganismi viventi (batteri, funghi, protozoi e virus), che abitano il tratto gastrointestinale (GI). Mentre il termine “microflora” è spesso usato nella letteratura più antica, il termine “microbiota” (da “bios”, “vita” in greco) è il termine appropriato.
I batteri sono i microbi più abbondanti nell’intestino (Swanson et al., 2011).

Fino a poco tempo fa, la coltura batterica tradizionale è stata comunemente utilizzata per identificare i batteri presenti nel tratto GI. Ora, è riconosciuto che la grande maggioranza dei batteri intestinali non può essere colturata usando tecniche di placcatura standard.

Non esiste alcuna correlazione tra i conteggi batterici nell’intestino tenue e lo status della malattia (German et al., 2003). La coltura fecale qualitativa non produce una sufficiente risoluzione per poter caratterizzare completamente il complesso microbiota dell’intestino crasso.

I metodi di sequenziamento molecolare, che mirano soprattutto al gene 16S rRNA, sono ora lo standard riconosciuto per l’identificazione del microbiota batterico.

Tali approcci hanno dimostrato che i tratti GI canini e felini hanno un ecosistema microbiale altamente complesso, composto di centinaia di diversi filotipi di batteri (Handl et al., 2011).

Si stima che ci siano circa un trilione (1012-1014) di cellule microbiche nel tratto GI, circa 10 volte più del numero di tutte le cellule dell’ospite. Inoltre, il pool genetico combinato di tutti i batteri intestinali supera il contenuto genetico dell’ospite, per un fattore di 100.

Questa nuova visione, in merito alla complessità del microbiota intestinale e della sua intima relazione con l’ospite, ha stimolato la ricerca per comprendere meglio l’importanza di un equilibrato ecosistema microbico, per la regolazione della salute e dell’immunità dell’ospite.

La disbiosi intestinale può essere definita come un’alterazione della composizione e/o della ricchezza (cioè, il numero di specie batteriche uniche) del microbiota intestinale. Gli studi sugli esseri umani e sulle specie veterinarie hanno associato la disbiosi intestinale con vari disturbi del GI, come la malattia infiammatoria intestinale (IBD), la colite granulomatosa e la sindrome dell’intestino irritabile (IBS) – (Suchodolski et al., 2012a, b; Honneffer et al., 2014; Minamoto et al., 2014).

Sebbene non sia sempre chiaro se la disbiosi sia una causa o un effetto della malattia GI, è probabile che si verifichino sovrapposizioni, in quanto l’infiammazione causerà la disbiosi, e recenti studi funzionali hanno dimostrato che la disbiosi, quando è presente, è un fattore di rischio che può esacerbare l’infiammazione in individui geneticamente suscettibili. Pertanto, il ristabilimento della normobiosi dovrebbe essere un risultato desiderato di trattamento.

Tuttavia, la ricerca per definire meglio le firme della disbiosi, come associata a diverse malattie, è ancora in fase precoce.

È anche importante notare che esiste una sovrapposizione, nei modelli di disbiosi di molte malattie GI.

A questo punto, non è stata descritta alcuna firma specifica di disbiosi per le malattie GI, che possa essere utilizzata diagnosticamente per distinguere i sottogruppi di enteropatie croniche (CE).

Tuttavia, attualmente, si stanno valutando vari indici di disbiosi e di alterazioni metaboliche, che in futuro potrebbero avere un’utilità diagnostica e terapeutica.

Questa revisione fornirà una breve panoramica dei metodi per valutare il microbiota GI e la disbiosi, i principali gruppi batterici nei tratti GI canini e felini, nonché il ruolo della disbiosi nella fisiopatologia delle malattie GI.

 

Valutazione del microbiota e della disbiosi

Non esiste un unico standard d’elezione, per la valutazione del microbiota e della disbiosi GI.

La maggior parte delle ricerche attuali è focalizzata sulla valutazione del microbiota batterico, e alcuni metodi, per la caratterizzazione dei batteri, sono stati ottimizzati.

Poiché il microbiota intestinale è un ecosistema complesso e dinamico, il miglior approccio diagnostico sarebbe quello di una combinazione di strumenti molecolari, che comprendano l’amplificazione PCR del gene 16S rRNA, utilizzando dei primer batterici universali, seguita da un’analisi di ampliconi mediante “sequenziamento di prossima generazione” (“sequenziamento in parallelo”, o NGS), da una diretta quantificazione di specifici taxa batterici mediante PCR quantitativa (qPCR) e dall’utilizzo dell’ibridazione fluorescente in situ (FISH), per visualizzare la traslocazione dei batteri nell’epitelio della mucosa.

Gli studi futuri dovranno inoltre includere le misurazioni dei metaboliti batterici, quali gli acidi biliari fecali e gli acidi grassi a catena corta (SCFA), per valutare la funzione del microbiota e valutare i cambiamenti nel sistema immunitario dell’ospite.

La coltura batterica può essere una tecnica utile, per la rilevazione di enteropatogeni specifici (ad es. Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Yersinia spp.). La colturazione consente la determinazione di un’infezione attiva (cioè, la vitalità degli organismi isolati), il test di sensibilità antibiotica degli esemplari clinici e la genotipizzazione degli isolati colturati per studi epidemiologici.

Tuttavia, è ora riconosciuto che la coltura batterica non è ben adatta per una caratterizzazione approfondita di ambienti complessi, come il tratto GI dei mammiferi.

Poiché la maggioranza dei batteri intestinali non può essere colturata, questo metodo sottostima i numeri batterici totali, e non consente nemmeno l’identificazione della maggioranza dei gruppi batterici nel tratto GI.

I motivi di questa incapacità di colturare la maggior parte dei batteri sono la mancanza di conoscenza, per quanto riguarda i loro fabbisogni di crescita ottimali, e il fatto che i tratti GI del cane e del gatto ospitano prevalentemente batteri anaerobi, che sono fragili e soggetti a danni da manipolazione.

Attualmente, si stima che meno del 20% dei batteri intestinali possano essere colturati con tecniche standard di laboratorio.

Gli strumenti molecolari consentono l’identificazione di microbi intestinali precedentemente non-caratterizzati; queste tecniche sono anche in grado di fornire informazioni sulla funzionalità del microbioma, mediante metagenomica. Sono disponibili diversi metodi, e tutti questi approcci potrebbero essere idealmente utilizzati in modo complementare (Tabella 1).

Tuttavia, la maggior parte di questi metodi è attualmente disponibile solo per la ricerca.

L’uso del NGS dei geni 16S rRNA è uno strumento utile, per valutare il microbiota intestinale, poiché questo approccio fornisce una panoramica delle proporzioni di tutti i gruppi batterici all’interno dell’intero microbiota. A causa dei suoi costi e dei tempi di risposta dei risultati, il NGS non è attualmente molto disponibile per l’uso diagnostico di routine.

Tuttavia, è importante notare che i gruppi batterici con minore abbondanza (in particolare gli agenti patogeni) sono tipicamente presenti in una percentuale così bassa di batteri totali, che potrebbero sfuggire all’identificazione anche qualora venissero impiegate tecniche di elevata produttività.

Pertanto, per la rilevazione o la quantificazione dei gruppi batterici in minore abbondanza, è consigliabile l’uso supplementare di specifici primer del gruppo PCR.

È importante notare che i filotipi batterici possono possedere più copie del gene 16SrRNA, che possono variare notevolmente di numero tra le singole specie batteriche (possono essere presenti da 1 a 15 copie del gene 16R rRNA). Pertanto, i risultati della qPCR non possono essere correlati direttamente ai conteggi assoluti delle cellule batteriche.

L’uso della FISH è attualmente considerato il metodo più accurato, per la quantificazione dei gruppi batterici, poiché essa si basa su conteggi microscopici, piuttosto che sull’amplificazione del DNA.

Tuttavia, questo approccio non consente un’analisi approfondita dei campioni.

Un ulteriore vantaggio della FISH è quello di visualizzare la localizzazione dei batteri, rispetto all’epitelio (cioè: intracellulare, aderente o invasiva).

Va inoltre osservato che gli strumenti molecolari, come le tecniche basate sul gene 16S rRNA, hanno limitazioni intrinseche. Il pregiudizio viene introdotto durante l’estrazione del DNA, la selezione dei primer, l’amplificazione PCR e l’analisi delle sequenze. Ad esempio, un’insufficiente lisi cellulare, durante l’estrazione del DNA, può sottostimare la popolazione di batteri Gram-positivi, mentre un protocollo di lisi troppo rigido può diminuire il recupero del DNA dai batteri Gram-negativi.

Alcuni, tra i primer e i protocolli PCR comunemente usati, sottostimano la presenza di gruppi batterici specifici, ad esempio il Bifidobacterium spp. In considerazione di questi potenziali pregiudizi, occorre fare attenzione, quando si confrontano i risultati quantitativi attraverso gli studi che hanno utilizzato diversi metodi di estrazione del DNA e diversi protocolli PCR.

Oltre all’identificazione dei gruppi batterici, una chiave per comprendere l’impatto del microbiota sulla salute GI è quello di esplorare la funzionalità della comunità microbica.

In metagenomica, il DNA viene estratto da un campione biologico, e viene quindi direttamente sequenziato senza una previa amplificazione di geni specifici.

I risultati forniscono un’istantanea della “riserva genica” e del potenziale funzionale del microbioma, e sono stati applicati per i cani (Swanson et al., 2011; Barry et al., 2012).

Un’area emergente è quella dell’indagine sul ruolo dei metaboliti dell’ospite e dei batteri, in vari disturbi GI.

Questo approccio può migliorare la nostra comprensione di percorsi metabolici complessi, con l’obiettivo di trovare nuovi biomarcatori per l’eziologia, la progressione e il trattamento delle malattie GI.

La misurazione mirata dei metaboliti specifici è già stata eseguita in medicina veterinaria: ad esempio, per le misurazioni delle concentrazioni sieriche di cobalamina e folato, e le concentrazioni fecali degli SCFA.

La metabolomica non-mirata è una tecnica che fornisce un profilo imparziale dei metaboliti, usando la spettrometria di massa. Diverse centinaia di metaboliti possono essere misurati in una singola analisi, e possono essere utilizzati per comprendere meglio le alterazioni delle vie biochimiche che si verificano come conseguenza dell’infiammazione e della disbiosi GI (ad esempio, alterazioni di vari aminoacidi, percorsi dei triptofani e dismetabolismo degli acidi biliari).

  

Microbiota gastrointestinale di cani e gatti sani

Utilizzando la coltura batterica tradizionale, gli studi iniziali hanno riferito che il carico batterico nell’intestino tenue dei cani sani varia da 102 a 105 “unità formanti colonie” (CFU)/g, ed alcuni studi riportano numeri fino a 109 CFU/g (German et al., 2003).

Nel colon, il numero di batteri colturabili è molto più elevato, rispetto all’intestino tenue, e va da 108 a 1011 CFU/g (Mentula et al., 2005). I gatti hanno un numero di batteri nel duodeno considerevolmente superiore, rispetto ai cani (Johnston et al., 1999).

I metodi molecolari hanno permesso un’identificazione più dettagliata dei batteri presenti all’interno dei tratti GI di cani e gatti (Suchodolski, 2011). L’intestino tenue ospita una miscela di batteri aerobi e batteri anaerobi facoltativi, mentre l’intestino crasso ospita quasi esclusivamente gli anaerobi (Suchodolski et al., 2008a). I Firmicutes, i Bacteroidetes, i Proteobacteria e i Fusobacteria sono i phyla batterici principali, e costituiscono circa il 99% di tutto il microbiota intestinale di cani e gatti (Handl et al., 2011; Chaban et al., 2012).

Gli Helicobacter spp. sono predominanti nello stomaco del cane, ma possono anche trovarsi ordinariamente gli Actinobacillus e gli Streptococcus spp. (Garcia-Mazcorro et al., 2012).

L’intestino tenue ospita prevalentemente Clostridium spp., Lactobacillales e Proteobacteria, mentre i Clostridiales, i Bacteroides spp., la Prevotella spp. ed i Fusobatteri predominano nel crasso.

Oltre alle differenze nella composizione del microbiota lungo il tratto GI, ciascun animale ospita un profilo microbico unico (Fig. 1) (Suchodolski et al., 2005).

Tuttavia, i metagenòmi (ossia, il contenuto genetico funzionale) sono conservati, e ciò suggerisce che gli aspetti funzionali dei microbiomi sono simili tra i singoli animali (Guard et al., 2016).

Gli algoritmi matematici possono essere usati per combinare in un unico numero i livelli dei vari gruppi batterici, che sono diversi per ciascun individuo (Figura 1), in modo da poter monitorare la direzione dei cambiamenti del microbiota, nella malattia e nella risposta alla terapia.

Anche i funghi e i virus sono membri importanti del microbiota, ma il loro ruolo nella salute e nella malattia è ancora in fase di valutazione. Sulla base dei conteggi sequenziali metagenomici, i funghi costituiscono circa il 2% delle cellule microbiche nei campioni fecali (Swanson et al., 2011).

I cani e i gatti ospitano più specie di funghi nel loro intestino; sono stati riportati fino a 40 diversi filotipi nei campioni fecali di singoli cani (Foster et al., 2013). Pertanto, ci aspettiamo di trovare occasionalmente dei funghi in esami fecali di routine.

Il ruolo dei funghi nella malattia GI è incerto, in quanto non sono state osservate chiare differenze tra i filotipi specifici, nel confronto tra campioni fecali di cani sani e di cani con diarrea acuta (Foster et al., 2013) o campioni duodenali di cani con CE (Suchodolski et al., 2008b).

 

Microbiota intestinale: Contributo alla salute

Un equilibrato ecosistema microbico è di fondamentale importanza per la salute dell’ospite, poiché fornisce stimoli per il sistema immunitario, aiuta nella difesa contro gli enteropatogeni e fornisce benefici nutrizionali.

La presenza di batteri è importante anche per un corretto sviluppo della struttura dell’intestino, dal momento che i topi privi di germi (gnotobiotici) hanno una alterata architettura epiteliale. Un’area di ricerca emergente è quella di capire come il microbiota moduli la salute e la malattia dell’ospite.

Diversi studi hanno descritto il microbiota intestinale e il suo pool genetico funzionale (metagenoma) nei cani e nei gatti (Swanson et al., 2011; Barry et al., 2012; Guard et al., 2015; Minamoto et al., 2015).

Le interazioni tra i batteri intestinali e il sistema immunitario dell’ospite sono mediate sia attraverso il contatto diretto tra i batteri e il sistema immunitario innato (ad es., i recettori di tipo Toll e i recettori NOD2), sia attraverso metaboliti microbici.

Questi metaboliti possono essere prodotti direttamente dai batteri (ad esempio, vitamine, acidi grassi a catena corta), o sono metaboliti primari dell’ospite che vengono convertiti attraverso enzimi batterici in metaboliti secondari (ad esempio, conversione di acidi biliari primari in secondari).

Gli acidi biliari sono un eccellente esempio delle strette interazioni tra l’ospite e il microbiota intestinale. Soltanto i batteri intestinali possono convertire gli acidi biliari primari (che entrano nel colon) in acidi biliari secondari.

Il rapporto ottimale tra acidi biliari primari e secondari è considerato un importante regolatore dell’omeostasi intestinale, poiché essi riducono l’infiammazione, inibiscono la germinazione delle spore del C. Difficile e modulano l’insulina e il metabolismo del glucosio, mediante l’attivazione del peptide 1 glucagonico (GLP-1) (Pavlidis et al., 2015).

La disbiosi dell’intestino porta ad alterazioni dell’acido biliare, con conseguenze metaboliche potenzialmente negative per l’ospite (Duboc et al., 2013).

Il phylum batterico dei Firmicutes, un costituente principale del microbiota intestinale, comprende molti gruppi batterici filogeneticamente distinti, il cosiddetto Gruppo Clostridium.

Questi gruppi (ad esempio, Ruminococcus, Faecalibacterium e Dorea spp.), insieme ai Bacteroidetes ed agli Actinobacteria (cioè, Bifidobacterium spp.), sono ritenuti degli importanti produttori dei metaboliti, che hanno un positivo impatto diretto sulla salute dell’ospite (Tabella 2).

Come esempi, le fonti di nutrienti dei batteri sono i carboidrati complessi (ad esempio, amido, cellulosa, pectina e inulina), e la fermentazione di questi substrati comporta principalmente la produzione di SCFA (ad esempio, acetato, propionato e butirrato). Questi fungono da fonti energetiche per l’ospite, regolano la motilità intestinale e sono importanti fattori di crescita per le cellule epiteliali.

Gli SCFA hanno anche proprietà antinfiammatorie, in quanto predispongono le cellule T immunoregolatrici (Treg) (Arpaia et al., 2013).

Altri metaboliti batterici, come gli acidi biliari secondari e l’indolo (un sottoprodotto del degrado del triptofano), sono anche anti-infiammatori, mantenendo così l’omeostasi immunitaria e rafforzando la funzione di barriera intestinale (Bansal et al., 2010; Duboc et al., 2013).

 

Il ruolo della disbiosi intestinale nella fisiopatologia delle malattie gastrointestinali

Alcune ragioni dello sviluppo della disbiosi sono riassunte nella Tabella 3.

I processi di malattia possono essere associati ai cambiamenti nella funzione del microbiota (ad esempio, la riduzione della produzione di SCFA e di altri metaboliti, ed un alterato gruppo enzimatico batterico), piuttosto che agli spostamenti nella composizione del microbiota. Queste alterazioni funzionali o immunologiche non sono facilmente individuabili, in quanto non siamo ancora in grado di valutare correttamente l’intero microbiota e le sue funzioni.

Il microbiota varia lungo il tratto GI, ed esistono anche chiare differenze tra il microbiota mucosale e quello luminale (Suchodolski et al., 2004, 2005; Manchester et al., 2013; White, 2015). Inoltre, è quasi impossibile valutare correttamente tutte le interazioni tra il microbiota e il sistema immunitario dell’ospite (Kathrani et al., 2012). Poiché questi fattori inaccessibili svolgono, probabilmente, un ruolo cruciale nella complesso comunicazione tra batteri e sistema immunitario dell’ospite, spesso una valutazione grezza dei cambiamenti batterici nei campioni intestinali non permette di rilevare l’intero processo della malattia.

Tuttavia, sono stati compiuti molti progressi nella caratterizzazione della disbiosi intestinale nelle malattie GI, e la metabolomica ha anche fornito approfondimenti sulle conseguenze funzionali della disbiosi e sul suo ruolo nella fisiopatologia di alcuni disturbi GI negli esseri umani (Duboc et al., 2013) e nei cani (Honneffer et al., 2015).

 

Microbiota intestinale nelle enteropatie acute e croniche

La disbiosi è stata descritta nei cani con malattie GI (ad es., IBD e diarrea acuta), nei gatti con CE, ed in cani e gatti infetti da Giardia duodenalis (Suchodolski et al., 2012b, 2015; Guard et al., 2015; Minamoto et al., 2015; Slapeta et al., 2015).

Nell’IBD umana e canina, si registrano aumenti nelle proporzioni di generi batterici appartenenti ai Proteobacteria (es., Escherichia coli, Diaphorobacter spp.) e diminuzioni di Fusobacteria, Bacteroidetes e dei membri dei Firmicutes (es. Faecalibacterium spp., Ruminococcaceae, Turicibacter spp. , Blautia spp.).

Questi cambiamenti sono stati osservati nel duodeno (Suchodolski et al., 2010, 2012a; Xenoulis et al., 2008) e nei campioni fecali (Suchodolski et al., 2012b; Honneffer et al., 2014; Minamoto et al., 2014, 2015) di cani con IBD. Ciò indica che, nonostante le differenze nella composizione microbica lungo il tratto GI, la disbiosi dovuta ad un processo di malattia nell’intestino tenue può essere identificata nei campioni fecali.

La disbiosi nel duodeno era correlata con la gravità dei punteggi istopatologici, ma non con la gravità della malattia clinica, ossia l’indice clinico di attività IBD (CIBDAI) (Suchodolski et al., 2012a).

Generalmente, vi è somiglianza tra i modelli di disbiosi osservati nella diarrea cronica e in quella acuta, ma sono state descritte alcune differenze notevoli. Ad esempio, nei campioni fecali di cani con diarrea emorragica acuta, sono stati riportati notevoli incrementi nelle popolazioni di Clostridium perfringens e Fusobacteria (Suchodolski et al., 2012b).

Al contrario, quest’ultimo taxon è tipicamente diminuito nelle feci di cani con IBD.

Un incremento del C. Perfringens, o la sua individuazione nei campioni fecali di cani con diarrea, sono comunemente ritenuti causativi. Tuttavia, uno studio recente suggerisce che la crescita di C. perfringens si verifica come effetto della disbiosi intestinale e della perdita del normale microbiota nella diarrea cronica (Minamoto et al., 2014). Il ruolo dell’enterotossina del C. Perfringens è stato anche studiato nella diarrea acuta (Busch et al., 2015).

Recentemente, è stata identificata una nuova “tossina formante pori” (netF), in un sottoinsieme di cani con diarrea emorragica canina (Mehdizadeh Gohari et al., 2015); questo può essere un focus dei futuri test diagnostici.

I gatti con IBD avevano aumentati conteggi duodenali di Enterobacteriaceae, come valutato mediante la FISH; questi conteggi sono stati positivamente correlati con i cambiamenti nell’architettura mucosale e con la densità degli infiltrati cellulari (Janeczko et al., 2008).

Meno si sa sulla disbiosi fecale nei gatti con IBD, in quanto solo due studi hanno valutato il microbiota fecale di gatti con IBD confermata, utilizzando la FISH per identificare i singoli gruppi batterici, anziché per sequenziare. Uno studio ha individuato un aumento del Desulfovibrio spp. nei gatti con IBD (Inness et al., 2007), mentre il secondo studio non ha trovato differenze tra gatti sani e gatti con IBD (Abecia, 2010).

In uno studio, che utilizza il sequenziamento 16S rRNA nei gatti con diarrea acuta e CE, ma senza diagnosi chiara, i gatti con diarrea cronica avevano diminuite proporzioni di Bacteroidetes, Faecalibacterium spp. e Turicibacter spp., e maggiori proporzioni di Enterobacteriaceae, similmente a quanto si può verificare per i cani con IBD (Suchodolski et al., 2015).

Gli studi sopra descritti hanno chiaramente identificato una disbiosi duodenale e fecale nei cani con IBD. Al momento attuale, nessun studio ha valutato se i modelli di disbiosi differiscano tra le varie forme di CE, l’enteropatia cibo-reattiva (FRE), l’enteropatia reattiva agli antibiotici (ARE) e l’IBD.

Sono necessari studi di follow-up a lungo termine, per esaminare se i cambiamenti nel microbiota siano ripristinabili con la remissione clinica.

Studi iniziali hanno riportato che il microbiota GI e il metaboloma sierico subiscono normalizzazioni solo minori, dopo 3 settimane (Minamoto et al., 2015; Figura 1) o dopo 8 settimane di terapia (Rossi et al., 2014), anche se i cani mostrano miglioramenti nei punteggi CIBDAI. Ciò suggerisce che il microbiota rimane alterato, a causa della malattia sottostante o dell’infiammazione istologica residua, presente nell’intestino (Rossi et al., 2014), che in genere non si risolve completamente in questo periodo di tempo. Ulteriori studi sono necessari per correlare l’esito a lungo termine degli animali colpiti (ossia, il tasso di ricaduta clinica) con la dinamica della disbiosi.

La disbiosi, inclusi i segni clinici associati ai cambiamenti nel microbiota, può anche essere indotta dalla somministrazione di agenti antimicrobici. Alcuni agenti antimicrobici ad ampio spettro, come il metronidazolo, inducono importanti cambiamenti nei taxa batterici; queste modifiche somigliano ai modelli di disbiosi osservati nella CE (Minamoto et al., 2014, 2015).

Pertanto, la somministrazione di antibiotici a cani sani può causare cambiamenti che simulano la disbiosi osservata nella malattia GI cronica. La continua somministrazione di antibiotici durante la terapia può portare alla falsa impressione, su campioni di follow-up, che la disbiosi sia persistente a causa della malattia GI, mentre le modifiche possono essere imputabili al trattamento antimicrobico.

Nei casi in cui gli antibiotici vengono somministrati cronicamente, la valutazione seriale della disbiosi deve essere interpretata con cautela.

 

Conseguenze funzionali della disbiosi nelle enteropatie croniche

Un microbioma disbiotico può essere direttamente deleterio per l’ospite; l’esaurimento del microbiota residente può portare a riduzioni dei metaboliti antinfiammatori.

Pertanto, è auspicabile una corretta caratterizzazione della disbiosi, per consentire una migliore comprensione del processo di malattia in animali con malattie GI, e per guidare le decisioni sul trattamento.

I cambiamenti nel microbiota comportano conseguenze funzionali e immunologiche per l’ospite, ma l’entità di tali cambiamenti dipenderà dalla grandezza e dal modello della disbiosi (vale a dire, quali gruppi batterici sono alterati) e dalla posizione della disbiosi (tenue vs crasso).

Una migliore comprensione di queste conseguenze filogenetiche e funzionali può comportare una migliore comprensione della patogenesi della malattia.

I batteri dell’intestino tenue vivono in un rapporto molto delicato con l’ospite, poiché molti di questi sono aderenti alla mucosa, e quindi sono importanti stimolatori dell’immunità mucosale.

I cambiamenti dietetici improvvisi, ivi compresa l’imprudenza dietetica, e i cambiamenti nell’architettura dell’intestino, coi susseguenti cambiamenti nella motilità intestinale (ad esempio, la creazione chirurgica di cicli intestinali, la sindrome dell’intestino corto e la resezione della valvola ileocolica), possono portare a cambiamenti nelle popolazioni batteriche.

L’insufficienza pancreatica esocrina (EPI) è stata associata ad un aumento del numero totale di batteri nel duodeno dei cani (Simpson et al., 1990). Tenui cambiamenti nella composizione del microbiota possono avere effetti significativi sulla risposta immunitaria dell’ospite.

Il microbiota può anche competere con l’ospite per i nutrienti, e può produrre metaboliti deleteri.

Il microbiota del tenue, in particolare il Lactobacillus spp. e il Clostridium spp. (C. hiranonis e C. scindens), decòniuga gli acidi biliari; una composizione microbica anormale può indebolire l’assorbimento dei grassi.

Altre funzioni anormali possono essere la deidrossilazione degli acidi grassi, la distruzione degli enzimi dal bordo a spazzola, i danni alle proteine trasportatrici e la concorrenza per i nutrienti (ad esempio, la vitamina B12).

Le enterotossine, prodotte dai batteri patogeni, possono stimolare le secrezioni del liquido mucosale, mentre la rottura dei villi e la perdita dell’area superficiale diminuiranno la capacità di assorbimento della mucosa, con conseguente diarrea. Una disfunzione della barriera mucosale può portare ad un aumento della permeabilità intestinale e ad una traslocazione batterica clinicamente significativa.

La disbiosi che si verifica nell’intestino crasso è tipicamente associata a diminuzioni nei principali taxa batterici abbondanti (ad esempio, Blautia spp., Faecalibacterium spp., Ruminococcaceae e Turicibacter spp., Fig. 1) che producono SCFA, indoli e altri metaboliti immunomodulatori. Pertanto, si prevedono importanti effetti sul metabolismo dell’ospite.

Di conseguenza, le diminuite abbondanze di Ruminococcaceae e Faecalibacterium spp. sono state correlate con la diminuzione delle concentrazioni fecali di propionato e con l’aumento delle concentrazioni fecali di butirrato, nei cani con diarrea acuta (Guard et al., 2015) e con IBD (Minamoto et al., 2015). I cani con diarrea acuta hanno avuto anche variazioni nel percorso del triptofano, come indicato dalle ridotte concentrazioni uriche di 2-metil-indolo e di 5-metossi-1H-indolo-3-carbaldeide, e dalla diminuzione di acido chinurenico sierico (un catabolita di chinurenina e triptofano), così come un ridotto rapporto tra triptofano ed acido chinurenico (Guard et al., 2015).

I cani con IBD avevano un profilo globale alterato nei metaboliti del siero, rispetto ai cani sani, con incrementi significativi nei percorsi di stress ossidativo (Minamoto et al., 2015).

Inoltre, il previsto metagenoma fecale era coerente con la diminuzione del metabolismo degli aminoacidi, e ciò suggerisce che il microbiota dei cani con IBD è coinvolto nel metabolismo proteico disfunzionale. Gli studi, che impiegano la metabolomica non mirata, hanno associato la disbiosi fecale alle riduzioni degli acidi biliari secondari immunomodulatori negli esseri umani (Duboc et al., 2013) e nei cani (Honneffer et al., 2015), ed ai percorsi triptofano-indolo nei cani (Guard et al. 2015).

La deplezione dei gruppi commensali (mappa del calore in Fig. 1) e dei loro rispettivi metaboliti immunoregolatori può compromettere la capacità dell’ospite di ridurre l’aberrante risposta immunitaria intestinale; così, la disbiosi diventa una componente della fisiopatologia del processo di malattia cronica.

Recenti studi epidemiologici negli esseri umani hanno rivelato che la disbiosi, causata dalla somministrazione di farmaci (ad esempio antibiotici, farmaci antiinfiammatori non steroidei, sostanze depressive dell’acido gastrico) è un importante fattore di rischio per alcune malattie croniche.

L’esposizione precoce agli antibiotici, nell’infanzia, è associata allo sviluppo di allergie (Metsala et al., 2015) e dell’obesità (Saari et al., 2015), presumibilmente dovute alla disbiosi indotta da antibiotici.

La riduzione della diversità del microbiota intestinale, al momento del trapianto di cellule staminali ematopoietiche allogeniche, è un fattore di rischio per una mortalità più elevata (Taur et al., 2015).

Questi dati iniziali negli esseri umani, uniti alla migliore comprensione delle proprietà immunomodulatorie del microbiota intestinale, suggeriscono che una corretta diagnosi ed una correzione della disbiosi diventeranno un importante obiettivo terapeutico. Ciò potrebbe includere l’uso di diete altamente digeribili e/o di una terapia con prebiotici / probiotici ed agenti antimicrobici.

Tuttavia, attualmente, non sono disponibili dati clinici sufficienti per formulare raccomandazioni su quali modelli di disbiosi risponderanno meglio a una data terapia.

 

Enteropatie croniche associate ai batteri mucosamente invasivi

La colite granulomatosa, talvolta designata come colite ulcerativa istiocitica, è una forma specifica di CE che risponde agli antibiotici, ed è stata associata all’infiltrazione della mucosa operata dall’E. coli invasivo e aderente nel colon. I Boxer giovani (tipicamente, <4 anni di età) sono colpiti più frequentemente, ed è stata proposta una suscettibilità genetica per questa razza.

Tuttavia, possono esserne colpite anche altre razze di cani, in particolare i giovani bulldog francesi.

La predisposizione di questi cani alla colite granulomatosa associata all’E. coli suggerisce che essi abbiano un difetto genetico, che pregiudica la loro capacità di eliminare l’E. coli invasivo.

L’analisi in situ delle biopsie della mucosa di cani con colite granulomatosa, effettuata utilizzando sonde FISH contro l’E. coli, evidenzia gruppi multifocali di batteri invasivi all’interno dei macrofagi nella mucosa intestinale. La terapia con antibiotici (cioè, enrofloxacina) per 8 settimane si correla alla remissione dalla malattia (Manchester et al., 2013).

 

Disbiosi del tenue: Diarrea reattiva agli antibiotici

Negli esseri umani, la sovracrescita batterica dell’intestino tenue (SIBO) è definita come un aumento del numero di batteri nel tenue (Johnston, 1999).

È attualmente in discussione, per i cani, l’esistenza di una simile sindrome. I primi studi hanno riscontrato un aumento nei conteggi dei batteri nei cani con diarrea, rispetto ai cani sani, e gli autori di questo studio hanno definito la SIBO come >104 batteri anaerobi o >105 CFU/mL totali nel succo duodenale a digiuno (Batt et al., 1983, Rutgers et al., 1995, 1996).

Tuttavia, negli studi successivi (German et al., 2003), sono stati trovati conteggi batterici sostanzialmente più elevati negli aspirati duodenali di cani sani. Inoltre, non vi era alcuna correlazione tra il numero di batteri nel duodeno e i segni clinici nei cani con CE (German et al., 2003).

Poiché questa sindrome risponde al trattamento antibiotico, alcuni autori stanno usando il termine “diarrea antibiotico-responsiva” (ARD) (Hall, 2011). Inoltre, è stato segnalato che un sottogruppo di cani, con diarrea antibiotico-responsiva, risponde specificamente alla tilosina; il termine “diarrea tilosina-reattiva” (TRD) è stato proposto per questo sottogruppo (Westermarck et al., 2005).

Attualmente non è disponibile alcun lavoro diagnostico che consenta una definizione migliore di questi sottogruppi.

Non è chiaro se questi cani abbiano la stessa sindrome, o se esistano sottogruppi che potrebbero essere classificati come sovracrescita batterica intestinale, disbiosi del tenue (SID), diarrea tilosina-reattiva (TRD) o, generalmente, diarrea antibiotico-reattiva (ARD). È importante notare che, in questa sindrome, non sono inclusi i disturbi causati da batteri potenzialmente patogeni, quali Salmonella spp., Campylobacter spp., Clostridium perfringens enterotossigenico e C. difficile.

Mentre i gatti sani sembrano avere conteggi batterici duodenali più alti, rispetto ai cani sani, e questi numeri non si differenziano da quelli nei gatti con enteropatie (Johnston et al., 1993), sembra vi sia un sottoinsieme di gatti con CE che rispondono favorevolmente alla somministrazione di antibiotici.

Diversi meccanismi fisiologici regolano la colonizzazione batterica dell’intestino tenue. Essi includono la secrezione di acido gastrico e di fattori antibatterici (ad es., secrezioni pancreatiche e biliari), e la motilità intestinale. Le anomalie, in uno o più di questi meccanismi di controllo, possono portare a una disbiosi dell’intestino tenue, con conseguenti segni clinici. Ad esempio, i cani che hanno ricevuto una terapia di soppressione dell’acido gastrico, con un inibitore della pompa protonica, hanno mostrato alterazioni nel microbiota dello stomaco e del tenue (Garcia-Mazcorro et al., 2012).

Il succo pancreatico contiene sostanze antimicrobiche, ed i cani con EPI hanno significativamente aumentato i conteggi batterici nell’intestino tenue (Westermarck et al., 1993). Ciò si associa ad una scarsa risposta alla terapia sostitutiva dell’enzima pancreatico.

La formazione di anelli, ciechi e stagnanti, nell’intestino tenue, è una ragione comune per la sovracrescita di batteri negli esseri umani, che può portare a segni di malattia GI cronica.

Alcune razze canine, quali quelle del Pastore Tedesco e dello Shar-Pei cinese, sembrano predisposte all’ARE. Per questi cani, si sospetta una suscettibilità genetica ad una disregolazione della risposta immunitaria, mediata dalla cellula, a normali microrganismi luminali.

Non è stata confermata la carenza di IgA, come fattore sottostante di rischio. L’istopatologia, nei pastori tedeschi e in altri cani con diarrea antibiotico-responsiva, è tipicamente riportata come IBD linfocitico-plasmocitica, da normale a lieve. Tuttavia, gli studi recenti hanno riportato una risposta anormale nell’immunità innata (alterata espressione dei recettori Toll-like) nei Pastori Tedeschi, che potrebbe portare ad una reazione iperattiva alla flagellina batterica nell’intestino tenue (Kathrani et al., 2012).

È difficile diagnosticare in modo definitivo la SID e la ARD. La coltura duodenale non è utile a questo scopo, e non sono stati riportati studi molecolari. Pertanto, non è chiaro quali gruppi batterici siano alterati.

Una diagnosi provvisoria può essere effettuata sulla base dei segni clinici, di alterati livelli di cobalamina e di folati nel siero, e con una terapia antibiotica. Tuttavia, poiché le malattie, causate da patogeni intestinali non rilevati, possono rispondere alla terapia antibiotica, una risposta positiva alla terapia non conferma necessariamente la presenza di una disbiosi del tenue.

Le diagnosi differenziali, come i parassiti, gli agenti patogeni batterici, la maldigestione causata da EPI, IBD, il linfoma intestinale, la linfangiectasia e l’intolleranza alimentare, dovrebbero essere escluse.

La valutazione istopatologica delle biopsie dell’intestino tenue è spesso irrilevante. Tuttavia, a volte è stata segnalata un’atrofia dei villi o una fusione. Anche gli animali colpiti dovrebbero essere valutati per i fattori sottostanti, quali le anomalie anatomiche.

 

Cobalamina sierica e concentrazioni di folati

Le concentrazioni sieriche di cobalamina possono essere diminuite, e le concentrazioni di folato sierico possono essere aumentate, nei cani con SID/ARD. I cambiamenti nel microbiota del tenue possono portare ad una maggiore utilizzazione batterica della cobalamina, con conseguente diminuzione dell’assorbimento di cobalamina dall’ileo.

I batteri, nel tenue e nel crasso distali, producono acido folico, ma l’assorbimento dei folati, attraverso le proteine trasportatrici, avviene nell’intestino tenue prossimale.

Quando i batteri produttori di folati si accumulano nell’intestino tenue prossimale, l’ospite assorbirà una aumentata quantità di folato batterico, con conseguente aumento della concentrazione di folati sierici. Tuttavia, l’assorbimento di cobalamina e folato dal tenue è molto complesso, e può essere influenzato da diversi meccanismi; pertanto, le modifiche non sono molto specifiche per la SID o la ARD. Una dieta ricca in folati può portare ad un aumento delle concentrazioni di folato sierico, indipendente dalla malattia.

L’infiammazione dell’ileo può danneggiare i recettori della cobalamina e, quindi, può portare al malassorbimento della cobalamina. I cani con EPI hanno una diminuita secrezione di prodotti antibatterici, con una successiva sovracrescita batterica nel tenue (Simpson et al., 1989). Di conseguenza, nei cani con EPI hanno spesso una maggiore concentrazione di folati nel siero. Pertanto, nei cani con un’anormale concentrazione sierica di cobalamina e/o folato, deve essere valutata l’immunoreattività trisino-simile (TLI) sierosa, per escludere l’EPI.

Contrariamente alle aspettative, la somministrazione di tilosina non porta ad una diminuzione delle concentrazioni di folato sierico o ad un aumento di quelle di cobalamina sierica (Ruaux et al., 2005).

Pertanto, le concentrazioni di folato sierico possono non riflettere il successo terapeutico, e dovrebbero essere sempre valutate insieme ai risultati clinici.

Quando si alterano le concentrazioni di cobalamina e di folato sierico, ciò suggerisce la SID, ma entrambe hanno una sensibilità e specificità relativamente basse per la diagnosi di SID; la sensibilità riportata della concentrazione di cobalamina sierica, per una diagnosi, è del 25-55%, ed è del 50-66% per la concentrazione di folato sierico (German et al., 2003).

 

Conclusioni

Siamo ancora in una fase precoce, per comprendere la complessità del microbiota intestinale e le conseguenze metaboliche della disbiosi nella malattia GI.

I recenti studi funzionali hanno collegato chiaramente la disbiosi ad una gamma di malattie nei cani e nei gatti. Tuttavia, in questo momento, non sono disponibili dati clinici sufficienti per poter formulare raccomandazioni su quali modelli di disbiosi risponderanno meglio a una terapia specifica, e gli animali interessati devono essere trattati in base all’intero quadro clinico.

Mentre, in alcuni animali, l’uso di agenti antimicrobici è utile (ad esempio, per gli animali con ARD), il loro uso può esacerbare la disbiosi in altre malattie GI che non rispondono agli antibiotici. Pertanto, sono necessari ulteriori studi clinici, che combinino i risultati dell’analisi filogenetica e di quella del microbiota funzionale, per meglio definire le varie firme e i vari approcci terapeutici alla disbiosi.

 

Dichiarazione di conflitto di interessi

L’autore è impiegato nel Laboratorio Gastrointestinale presso la Texas A&M University, che offre test di funzionalità gastrointestinale su base a pagamento.

 

Legenda della figura

Fig. 1. Disbiosi nei cani con malattia intestinale infiammatoria idiopatica (IBD) prima e dopo 3 settimane di terapia. Questa figura mostra come gli stessi dati possano essere illustrati da una mappa termica e da vari algoritmi matematici, che tengano conto della composizione batterica all’interno di ciascun campione fecale.

Il DNA fecale viene estratto, e poi la composizione batterica viene identificata mediante l’amplificazione dei geni 16S rRNA, seguita dal sequenziamento. Dati basati su Minamoto et al., (2015). In alto a sinistra: i dati possono essere visualizzati, utilizzando la trama principale di analisi delle coordinate (PCoA), dove i dati vengono visualizzati attraverso le due coordinate principali (PCoA 1 e 2). Ogni punto rappresenta la comunità batterica totale all’interno di un campione. Più vicini sono i due punti, più simile è la loro comunità batterica (cioè, condividono molti taxa batterici).

Più c’è distanza tra due punti, maggiore è la differenza tra le due comunità batteriche. Ogni punto (cioè, ogni campione) viene colorato per fenotipo, in questo caso: cani sani (rossi), cani con IBD prima della terapia (blu) e cani con IBD 3 settimane dopo la terapia medica (verde).

La figura a sinistra mostra che i cani sani si raggruppano più strettamente, e sono più lontani dai cani con IBD, ad indicare le differenze nel microbiota fecale tra cani sani e cani con IBD.

Tre settimane dopo la terapia, e nonostante il miglioramento nell’attività della malattia clinica (punteggio CIBDAI), il microbiota è cambiato solo leggermente, e non si è ancora raggruppato più vicino al microbiota dei cani sani. In basso a sinistra: gli stessi dati vengono visualizzati come un indice che riassume le abbondanze dei principali taxa batterici in ciascun campione fecale, come un singolo valore numerico (un numero positivo indica la disbiosi).

Questo indice può quindi essere utilizzato per monitorare i cambiamenti nel microbiota intestinale nel tempo. Come nella figura a sinistra, i dati indicano che, dopo 3 settimane di terapia, il microbiota non è tornato in uno stato simile a quello dei cani sani.

Destra: i generi batterici più abbondanti di questi cani sono visualizzati come una mappa termica. Ogni colonna rappresenta i generi batterici in ciascun campione; ogni riga riassume l’abbondanza di questi generi (più sono rosse, e più è elevata l’abbondanza). La mappa termica mostra che i principali generi abbondanti nei cani sani sono diminuiti nei cani con IBD.

 

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The Veterinary Journal

Volume 215, September 2016, Pages 30-37

 

Diagnosis and interpretation of intestinal dysbiosis in dogs and cats

Accepted Manuscript

Author: Jan Suchodolski

PII:  S1090-0233(16)30033-8

DOI:  http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.tvjl.2016.04.011

Reference: YTVJL 4804

To appear in: The Veterinary Journal

Accepted date: 21-4-2016

Please cite this article as:  Jan Suchodolski, Diagnosis and interpretation of intestinal dysbiosis in dogs and cats, The Veterinary Journal (2016), http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.tvjl.2016.04.011.

This is a PDF file of an unedited manuscript that has been accepted for publication.  As a service to our customers we are providing this early version of the manuscript.  The manuscript will undergo copyediting, typesetting, and review of the resulting proof before it is published in its final form.  Please note that during the production process errors may be discovered which could affect the content, and all legal disclaimers that apply to the journal pertain.

 

Review Article

 Diagnosis and interpretation of intestinal dysbiosis in dogs and cats

Jan Suchodolski*

Gastrointestinal Laboratory, Texas A&M University (TAMU), College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, 4474 TAMU, College Station, Texas 77843-4474, USA

* Corresponding author. Tel.: +1 979 4580933

E-mail address: Jsuchodolski@cvm.tamu.edu (J. Suchodolski).

 

Highlights

  • The gastrointestinal (GI) tract harbors a complex microbiota, which consists of bacteria, fungi, viruses and protozoa.
  • Molecular methods are now the standard techniques for assessing intestinal dysbiosis in dogs and cats with GI disease.
  • Loss of commensal microbiota is associated with decreased short chain fatty acids and bile acids.
  • Dysbiosis is a risk factor that may exacerbate inflammation in genetically susceptible dogs and cats.

 

Abstract

The intestinal tracts of dogs and cats harbor a highly complex microbiota, which consists of bacteria, fungi, viruses and protozoa. Until recently, traditional bacterial culture was commonly used to identify bacteria present in the gastrointestinal tract, but it is now well recognized that standard plating techniques do not have enough resolution for identification of the mostly anaerobic bacteria that reside within the gut. Molecular methods are now established for assessing intestinal dysbiosis in dogs and cats with gastrointestinal disease, but these approaches are not yet widely available for routine diagnosis. The loss of normal commensal bacterial microbiota (i.e. Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, and Faecalibacterium spp.) in acute and chronic intestinal diseases has been linked to metabolic changes, for example alterations in immunomodulatory bacterial metabolites, such as short chain fatty acids and secondary bile acids. This highlights the importance of dysbiosis in the pathophysiology of gastrointestinal diseases. Development of molecular based assays for specific bacterial groups, calculations of microbial dysbiosis indices and assays for microbial functional metabolites are currently underway to help assess dysbiosis. These will yield a better understanding of the pathophysiology of gastrointestinal diseases and may also lead to new diagnostic and therapeutic approaches to dysbiosis.

Keywords: Canine; Feline; Bile acids; Dysbiosis; Microbiome; Microbiota

Introduction

The intestinal microbiota is the consortium of all living microorganisms (bacteria, fungi, protozoa and viruses) that inhabit the gastrointestinal (GI) tract. Whilst the term ‘microflora’ is often used in the older literature, ‘microbiota’ (from ‘bios’, Greek: ‘life’) is the proper term. Bacteria are the most abundant microbes in the intestine (Swanson et al., 2011).

Until recently, traditional bacterial culture was commonly used to identify bacteria present in the GI tract. It is now recognized that the vast majority of intestinal bacteria cannot be cultured using standard plating techniques.

There is no correlation between bacterial counts in the small intestine and disease status (German et al., 2003). Qualitative fecal culture does not yield enough resolution to characterize the complex large intestinal microbiota comprehensively. Molecular sequencing methods, mostly targeting the 16S rRNA gene, are now the recognised standard for identification of bacterial microbiota. Such approaches have demonstrated that the canine and feline GI tracts harbor a highly complex microbial ecosystem, consisting of several hundred different bacterial phylotypes (Handl et al., 2011).

An estimated trillion (1012-1014) microbial cells are present in the GI tract, which is approximately 10 times more than the number of all host cells. Furthermore, the combined genetic pool of all intestinal bacteria outnumbers the host gene content by a factor of 100.

This new insight into the complexity of the intestinal microbiota and its intimate relationship with the host has spurred research to better understand the importance of a balanced microbial ecosystem for regulation of host health and immunity. Intestinal dysbiosis can be defined as an alteration in the composition and/or richness (i.e. the number of unique bacterial species) of the intestinal microbiota. Studies in human beings and veterinary species have associated intestinal dysbiosis with various GI disorders, such as inflammatory bowel disease (IBD), granulomatous colitis and irritable bowel syndrome (IBS) (Suchodolski et al., 2012a, b; Honneffer et al., 2014; Minamoto et al., 2014).

Although it is not always clear whether dysbiosis is a cause or an effect of GI disease, there is likely to be an overlap, since inflammation will cause dysbiosis, and recent functional studies have demonstrated that dysbiosis, when present, is a risk factor that may exacerbate inflammation in genetically susceptible individuals. Therefore, reestablishment of normobiosis should be a desired treatment outcome. However, research to better define signatures of dysbiosis associated with different diseases is still at an early stage.

It is also important to note that there is an overlap in the dysbiosis patterns of many GI diseases. At this time, no specific dysbiosis signatures for GI diseases have been described that can be used diagnostically to distinguish subsets of chronic enteropathies (CE). However, various dysbiosis indices and metabolic alterations currently are being evaluated, and these may have diagnostic and therapeutic utility in the future. This review will provide a brief overview of methods to assess the GI microbiota and dysbiosis, the major bacterial groups in the canine and feline GI tracts, and the role of dysbiosis in the pathophysiology of GI diseases.

 

Assessment of microbiota and dysbiosis

There is no single gold standard for assessing the GI microbiota and dysbiosis. Most current research is focused on evaluating the bacterial microbiota and methods have been optimized for characterization of bacteria. Since the gut microbiota is a complex and dynamic ecosystem, the best diagnostic approach would be a combination of molecular tools that include PCR amplification of 16S rRNA genes using broad universal bacterial primers, followed by analysis of amplicons by next generation (NGS) sequencing, direct quantification of specific bacterial taxa by quantitative PCR (qPCR) and the use of fluorescent in situ hybridization (FISH) to visualize the translocation of bacteria into the mucosal epithelium.

Future studies will also need to incorporate measurements of bacterial metabolites, such as fecal bile acids and short chain fatty acids (SCFA), to assess microbiota function and to evaluate changes in the host immune system.

Bacterial culture can be a useful technique for detection of specific enteropathogens (e.g., Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Yersinia spp.). Cultivation allows determination of an active infection (i.e. viability of isolated organisms), antibiotic sensitivity testing of clinical specimens and genotyping of cultured isolates for epidemiological studies. However, it is now recognized that bacterial culture is not well suited for in-depth characterization of complex environments, such as the mammalian GI tract. Since the majority of intestinal bacteria cannot be cultured, this method underestimates total bacterial numbers and also does not allow identification of the majority of bacterial groups in the GI tract. Reasons for the inability to culture most bacteria include lack of knowledge regarding their optimal growth requirements and because the canine and feline GI tracts harbor predominantly anaerobic bacteria, which are fragile and prone to handling damage. It is currently estimated that less than 20% of intestinal bacteria are cultivable with standard laboratory techniques.

Molecular tools allow the identification of previously uncharacterized intestinal microbes and these techniques are also able to provide information about the functionality of the microbiome by means of metagenomics. Several methods are available and all of these approaches ideally would be used in a complementary fashion (Table 1). However, most of these methods are currently available for research only. The use of NGS of 16S rRNA genes is a useful tool to assess the intestinal microbiota, since this approach provides an overview of the proportions of all bacterial groups within the entire microbiota. Due to costs and turnaround time of results, NGS is not currently widely available for routine diagnostic use.

However, it is important to note that bacterial groups with low abundance (especially pathogens) are typically present at such a low proportion of the total bacteria that they may escape identification even when high throughput techniques are employed. Therefore, for the detection or quantification of bacterial groups in low abundance, the additional use of group specific PCR primers is recommended.

It is important to note that bacterial phylotypes can possess multiple copies of the 16S rRNA gene, which can vary vastly in number amongst individual bacterial species (1-15 copies of the 16S rRNA gene can be present). Therefore, qPCR results cannot be related directly to absolute bacterial cell counts. The use of FISH is currently considered to be the most accurate method for quantification of bacterial groups because it is based on microscopic counts rather than amplification of DNA. However, this approach does not allow high throughput analysis of samples. A further advantage of FISH is to visualize the location of bacteria with regard to the epithelium (i.e. intracellular, adherent or invasive).

It also should be noted that molecular tools, such as 16S rRNA gene based techniques, have inherent limitations. Bias is introduced during DNA extraction, primer selection, PCR amplification and sequence analysis. As examples, insufficient cell lysis during DNA extraction can underestimate the population of Gram positive bacteria, whilst a lysis protocol that is too harsh can diminish DNA recovery from Gram negative bacteria. Some commonly used primers and PCR protocols underestimate the presence of specific bacterial groups, for example Bifidobacterium spp. In view of these potential biases, caution should be applied when comparing quantitative results across studies that have used different DNA extraction methods and PCR protocols.

In addition to identification of bacterial groups, a key to understanding the impact of the microbiota on GI health is to explore the functionality of the microbial community. In metagenomics, DNA is extracted from a biological sample and is then directly sequenced without prior amplification of specific genes. The results yield a snapshot of the gene pool and functional potential of the microbiome, and have been applied in dogs (Swanson et al., 2011; Barry et al., 2012). An emerging area is investigation of the role of host and bacterial metabolites in various GI disorders. This approach can improve our understanding of complex metabolic pathways, with the goal to find novel biomarkers for the etiology, progression and treatment of GI diseases. Targeted measurement of specific metabolites has already been performed in veterinary medicine, for example measurements of serum concentrations of cobalamin and folate, and fecal concentrations of SCFA.

Untargeted metabolomics is a technique that provides an unbiased profile of metabolites using mass spectrometry. Several hundred metabolites can be measured in a single analysis and can be used to better understand the alterations in biochemical pathways that occur as a consequence of GI inflammation and dysbiosis (e.g. alterations in various amino acids, tryptophan pathways and bile acid dysmetabolism).

 

Gastrointestinal microbiota of healthy dogs and cats

Using traditional bacterial culture, initial studies reported that the bacterial load in the small intestine of healthy dogs ranges from 102 to 105 colony forming units (CFU)/g, with some studies observing numbers as high as 109 CFU/g (German et al., 2003). In the colon, the number of cultivable bacteria is much higher than the small intestine, ranging from 108 to 1011 CFU/g (Mentula et al., 2005). Cats consistently have higher numbers of bacteria in their duodenum than dogs (Johnston et al., 1999).

Molecular methods have enabled more detailed identification of bacteria present within the canine and feline GI tracts (Suchodolski, 2011). The small intestine harbors a mixture of aerobic and facultatively anaerobic bacteria, while the large intestine is home almost exclusively to anaerobes (Suchodolski et al., 2008a). Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria and Fusobacteria are the major bacterial phyla, constituting approximately 99% of all gut microbiota in dogs and cats (Handl et al., 2011; Chaban et al., 2012).

Helicobacter spp. predominate in the canine stomach, but Actinobacillus and Streptococcus spp. also can be found routinely (Garcia-Mazcorro et al., 2012). The small intestine harbors predominantly Clostridium spp., Lactobacillales and Proteobacteria, while Clostridiales, Bacteroides spp., Prevotella spp. and Fusobacteria predominate in the large intestine. In addition to differences in the composition of the microbiota along the GI tract, each animal harbors a unique microbial profile (Fig. 1) (Suchodolski et al., 2005). However, the metagenomes (i.e. functional gene content) are conserved, suggesting that functional aspects of the microbiomes are similar across individual animals (Guard et al., 2016). Mathematical algorithms can be used to combine levels of various bacterial groups that are different for each individual into one number (Fig. 1), which can be used to track the direction of changes in the microbiota in disease and in response to therapy.

Fungi and viruses also are important members of the microbiota, but their role in health and disease is still being evaluated. Based on metagenomic sequence counts, fungi make up approximately 2% of microbial cells in fecal samples (Swanson et al., 2011). Dogs and cats harbor multiple fungal species in their gut; up to 40 different phylotypes were reported in fecal samples of individual dogs (Foster et al., 2013). Therefore, we expect to find fungi occasionally on routine fecal examinations. The role of fungi in GI disease is uncertain, since no clear differences in specific phylotypes were observed when fecal samples of healthy dogs were compared with fecal samples of dogs with acute diarrhea (Foster et al., 2013) or duodenal samples of dogs with CE (Suchodolski et al., 2008b).

 

Intestinal microbiota: Contribution to health

A balanced microbial ecosystem is of crucial importance for host health, since it provides stimuli for the immune system, helps in the defense against enteropathogens and provides nutritional benefits. The presence of bacteria is also important for proper development of gut structure, since germ-free (gnotobiotic) mice have an altered epithelial architecture. An emerging research area is understanding how microbiota modulate host health and disease. Several studies have described the intestinal microbiota and its functional gene pool (metagenome) in dogs and cats (Swanson et al., 2011; Barry et al., 2012; Guard et al., 2015; Minamoto et al., 2015). The interactions between intestinal bacteria and the host immune system are mediated either via direct contact between bacteria and the innate immune system (e.g. Toll-like receptors, NOD2 receptors) or through microbial metabolites. These metabolites can be produced directly by bacteria (e.g. vitamins, short chain fatty acids), or are primary host metabolites that are converted through bacterial enzymes into secondary metabolites (e.g. conversion of primary to secondary bile acids).

Bile acids are an excellent example of the close interactions between the gut microbiota and the host. Only gut bacteria can convert primary bile acids that enter the colon into secondary bile acids. The optimal ratio of primary to secondary bile acids is considered to be an important regulator of gut homeostasis, since they downregulate inflammation, inhibit germination of C. difficile spores, and modulate insulin and glucose metabolism through activation of glucagon-like peptide 1 (GLP-1) (Pavlidis et al., 2015). Gut dysbiosis leads to bile acid alterations, with potential negative metabolic consequences for the host (Duboc et al., 2013).

The bacterial phylum Firmicutes, a major constituent of intestinal microbiota, comprises many phylogenetically distinct bacterial groups, the so called Clostridium clusters.

These groups (e.g. Ruminococcus, Faecalibacterium and Dorea spp.), together with Bacteroidetes and Actinobacteria (i.e. Bifidobacterium spp.) are believed to be important producers of metabolites that have a direct beneficial impact on host health (Table 2). As examples, nutrient sources for bacteria are complex carbohydrates (e.g. starch, cellulose, pectin and inulin) and fermentation of these substrates results mainly in the production of SCFA (e.g. acetate, propionate and butyrate). These act as energy sources for the host, regulate intestinal motility and are important growth factors for epithelial cells. SCFA also have anti-inflammatory properties, since they induce immunoregulatory T cells (Treg) (Arpaia et al., 2013). Other bacterial metabolites, such as secondary bile acids and indole (a byproduct of tryptophan degradation), are also anti-inflammatory, thereby maintaining immune homeostasis and strengthening intestinal barrier function (Bansal et al., 2010; Duboc et al., 2013).

 

The role of intestinal dysbiosis in the pathophysiology of gastrointestinal diseases

Some reasons for the development of dysbiosis are summarized in Table 3. Disease processes may be associated with changes in microbiota function (e.g. reduced production of SCFA and other metabolites, and an altered bacterial enzyme pool) rather than shifts in microbiota composition. These functional or immunological alterations are not readily detected, since we are still not able to properly assess the entire microbiota and its functions.

The microbiota varies along the GI tract, and there are also clear differences between mucosal and luminal microbiota (Suchodolski et al., 2004, 2005; Manchester et al., 2013; White, 2015). Furthermore, it is almost impossible to properly assess the entire interactions between the microbiota and the host immune system (Kathrani et al., 2012). Since these inaccessible factors are likely to play a crucial role in the intricate communication between bacteria and the host immune system, crude assessment of bacterial changes in intestinal samples most often does not reveal the entire disease process. Nevertheless, much progress has been made in characterizing intestinal dysbiosis in GI diseases, and metabolomics have also provided insights into the functional consequences of dysbiosis and its role in the pathophysiology of some GI disorders in human beings (Duboc et al., 2013) and dogs (Honneffer et al., 2015).

 

Intestinal microbiota in acute and chronic enteropathies

Dysbiosis has been described in dogs with GI diseases (e.g. IBD and acute diarrhea), in cats with CE, and in dogs and cats infected with Giardia duodenalis (Suchodolski et al., 2012b, 2015; Guard et al., 2015; Minamoto et al., 2015; Slapeta et al., 2015). In human and canine IBD, there are increases in the proportions of bacterial genera belonging to Proteobacteria (e.g. Escherichia coli, Diaphorobacter spp.) and decreases in Fusobacteria, Bacteroidetes, and members of the Firmicutes (e.g. Faecalibacterium spp., Ruminococcaceae, Turicibacter spp., Blautia spp.). These changes have been observed in the duodenum (Suchodolski et al., 2010, 2012a; Xenoulis et al., 2008) and in fecal samples (Suchodolski et al., 2012b; Honneffer et al., 2014; Minamoto et al., 2014, 2015) of dogs with IBD. This indicates that, despite differences in microbial composition along the GI tract, dysbiosis due to a disease process in the small intestine can be identified in fecal samples. The dysbiosis in the duodenum was correlated with the severity of histopathological scores, but not with clinical disease severity, i.e. clinical IBD activity index (CIBDAI) (Suchodolski et al., 2012a).

Generally, there is similarity in the patterns of dysbiosis observed in chronic versus acute diarrhea, but some notable differences have been described. As an example, in fecal samples of dogs with acute hemorrhagic diarrhea, substantial increases in the populations of Clostridium perfringens and Fusobacteria have been reported (Suchodolski et al., 2012b). In contrast, the latter taxon is typically decreased in feces of dogs with IBD. An increase in C. perfringens or its detection in fecal samples of dogs with diarrhea is commonly believed to be causative. However, a recent study would suggest that C. perfringens overgrowth occurs as an effect of intestinal dysbiosis and the loss of normal microbiota in chronic diarrhea (Minamoto et al., 2014). The role of C. perfringens enterotoxin has also been questioned in acute diarrhea (Busch et al., 2015). A novel pore forming toxin (netF) has been recently identified in a subset of dogs with canine hemorrhagic diarrhea (Mehdizadeh Gohari et al., 2015); this may be a focus of future diagnostic testing.

Cats with IBD had increased duodenal counts of Enterobacteriaceae, as assessed by fluorescence in situ hybridization (FISH); these counts were positively correlated with changes in mucosal architecture and the density of cellular infiltrates (Janeczko et al., 2008).

Less is known about fecal dysbiosis in cats with IBD, since only two studies have evaluated the fecal microbiota of cats with confirmed IBD, using FISH to identify individual bacterial groups rather than sequencing. One study identified an increase in Desulfovibrio spp. in cats with IBD (Inness et al., 2007), while the second study did not find any differences between healthy cats and cats with IBD (Abecia, 2010). In a study utilizing 16S rRNA sequencing in cats with acute and CE, but with no clear diagnosis, cats with chronic diarrhea had decreased proportions of Bacteroidetes, Faecalibacterium spp. and Turicibacter spp., and increased proportions of Enterobacteriaceae, similar to dogs with IBD (Suchodolski et al., 2015).

The above studies have clearly identified duodenal and fecal dysbiosis in dogs with IBD. At the present time, no studies have evaluated whether dysbiosis patterns differ between the various forms of CE, food responsive enteropathy (FRE), antibiotic responsive enteropathy (ARE) and IBD. Long term follow-up studies are needed to examine whether the changes in microbiota revert with clinical remission. Initial studies have reported that the GI microbiota and serum metabolome undergo only minor normalization after 3 weeks (Minamoto et al., 2015; Fig. 1) or 8 weeks of therapy (Rossi et al., 2014), even if dogs show improvement in CIBDAI scores. This suggests that the microbiota remains altered due to the underlying disease or the residual histological inflammation present in the intestine (Rossi et al., 2014), which typically does not fully resolve in this time frame. Further studies are needed to correlate the long term outcome of affected animals (i.e. rate of clinical relapse) with the dynamics of dysbiosis.

Dysbiosis, including clinical signs associated with changes in the microbiota, can also be induced by administration of antimicrobial agents. Some broad spectrum antimicrobial agents, such as metronidazole, induce major changes in bacterial taxa; these changes resemble the dysbiosis patterns that are observed in CE (Minamoto et al., 2014, 2015). Therefore, administration of antibiotics to healthy dogs may cause changes that mimic the dysbiosis seen in chronic GI disease. Continued administration of antibiotics during therapy may lead to the false impression on follow-up samples that the dysbiosis is persistent due to GI disease, whereas the changes may be attributable to antimicrobial treatment. In cases where antibiotics are administered chronically, serial evaluation of dysbiosis should be interpreted with care.

 

Functional consequences of dysbiosis in chronic enteropathies

A dysbiotic microbiome may be directly deleterious to the host or the depletion of resident microbiota may lead to reductions in anti-inflammatory metabolites. Therefore, proper characterization of dysbiosis is desirable to enable a better understanding of the disease process in animals with GI disease and to guide treatment decisions. Changes in microbiota result in functional and immunological consequences for the host, but the extent of these changes will depend on the magnitude and the pattern of dysbiosis (i.e. which bacterial groups are altered) and the location of dysbiosis (small versus large intestine). A better understanding of these phylogenetic and functional consequences may result in a better understanding of disease pathogenesis.

Bacteria in the small intestine reside in a very delicate relationship with the host, since many are adherent to the mucosa and, therefore, are important stimulants of mucosal immunity. Sudden dietary changes, including dietary indiscretion, and changes in the architecture of the intestine, with subsequent changes in intestinal motility (e.g. surgical creation of intestinal loops, short bowel syndrome and resection of the ileocolic valve) may lead to changes in bacterial populations. Exocrine pancreatic insufficiency (EPI) has been associated with an increase in total bacterial counts in the duodenum of dogs (Simpson et al., 1990). Subtle changes in microbiota composition may have significant effects on the immune response of the host. The microbiota may also compete with the host for nutrients and may produce deleterious metabolites. Small intestinal microbiota, especially Lactobacillus spp. and Clostridium spp. (C. hiranonis and C. scindens) deconjugate bile acids; an abnormal microbial composition may impair fat absorption. Other abnormal functions may be the dehydroxylation of fatty acids, destruction of brush border enzymes, damage of carrier proteins and competition for nutrients (e.g. vitamin B12). Enterotoxins produced by pathogenic bacteria can stimulate mucosal fluid secretions, while villous effacement and loss of surface area will diminish mucosal absorptive capacity, resulting in diarrhea. A dysfunction of the mucosal barrier can lead to an increase in intestinal permeability and clinically significant bacterial translocation.

Dysbiosis that occurs in the large intestine is typically associated with decreases in the major abundant bacterial taxa (e.g. Blautia spp., Faecalibacterium spp., Ruminococcaceae and Turicibacter spp.; Fig. 1), which produce SCFA, indoles and other immunomodulatory metabolites. Therefore, major effects on host metabolism are expected. Consequently, decreased abundances of Ruminococcaceae and Faecalibacterium spp. were correlated with decreased fecal propionate and increased fecal butyrate concentrations in dogs with acute diarrhea (Guard et al., 2015) and IBD (Minamoto et al., 2015). Dogs with acute diarrhea also had changes in the tryptophan pathway, as indicated by decreased urine concentrations of 2-methyl indole and 5-methoxy-1H-indole-3-carbaldehyde, and decreased serum kynurenic acid (a catabolite of kynurenine and tryptophan), as well as a decreased ratio of tryptophan to kynurenic acid (Guard et al., 2015).

Dogs with IBD had an altered global profile in serum metabolites compared to healthy dogs, with significant increases in oxidative stress pathways (Minamoto et al., 2015).

Furthermore, the predicted fecal metagenome was consistent with decreased amino acid metabolism, suggesting that the microbiota of dogs with IBD is involved in dysfunctional protein metabolism. Studies employing untargeted metabolomics have associated fecal dysbiosis with reductions in immunomodulatory secondary bile acids in human beings (Duboc et al., 2013) and dogs (Honneffer et al., 2015), and tryptophan-indole pathways in dogs (Guard et al., 2015). Depletion of commensal groups (heat map in Fig. 1) and their respective immunoregulatory metabolites may impair the ability of the host to down-regulate the aberrant intestinal immune response; thus, dysbiosis becomes a component of the pathophysiology of the chronic disease process.

Recent epidemiological studies in human beings have revealed that dysbiosis caused by administration of drugs (e.g. antibiotics, non-steroidal anti-inflammatory drugs, gastric acid suppressants) is an important risk factor for some chronic diseases. Early exposure to antibiotics in childhood is associated with development of allergies (Metsala et al., 2015) and obesity (Saari et al., 2015), presumably due to antibiotic induced dysbiosis. Reduced diversity of the gut microbiota at the time of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is a risk factor for higher mortality outcomes (Taur et al., 2015). These initial data in human beings, combined with our better understanding of the immunomodulatory properties of the gut microbiota, suggest that proper diagnosis and correction of dysbiosis will become an important therapeutic goal. This could include the use of highly digestible diets and/or prebiotics, probiotic therapy and antimicrobial agents. However, not enough clinical data is currently available to make recommendations as to which dysbiosis patterns will respond best to which therapy.

 

Chronic enteropathies associated with mucosally invasive bacteria

Granulomatous colitis, sometimes designated histiocytic ulcerative colitis, is a specific form of CE, which responds to antibiotics and has been associated with mucosal infiltration of invasive and adherent E. coli in the colon. Young Boxer dogs (typically <4 years of age) are affected most frequently and a genetic susceptibility has been proposed for this breed.

However, other dog breeds, especially young French Bulldogs, may be affected. The predisposition of these dogs to E. coli associated granulomatous colitis suggests they harbor a genetic defect that impairs their ability to eliminate invasive E. coli. In situ analysis of mucosal biopsies from dogs with granulomatous colitis using FISH probes against E. coli demonstrates multifocal clusters of invasive bacteria within macrophages in the intestinal mucosa. Therapy with antibiotics (i.e. enrofloxacin) for 8 weeks correlates with remission from disease (Manchester et al., 2013).

 

Small intestinal dysbiosis: Antibiotic responsive diarrhea

In human beings, small intestinal bacterial overgrowth (SIBO) is defined as an increased bacterial count in the small intestine (Johnston, 1999). In dogs, the existence of a similar syndrome is currently under debate. Early studies found increased bacterial counts in dogs with diarrhea compared to healthy dogs and the authors of this study defined SIBO as >104 anaerobic bacteria or >105 total CFU/mL in fasting duodenal juice (Batt et al., 1983; Rutgers et al., 1995, 1996). However, substantially higher bacterial counts in duodenal aspirates of healthy dogs have been found in subsequent studies (German et al., 2003). Furthermore, there was no correlation between the number of bacteria in the duodenum and clinical signs in dogs with CE (German et al., 2003).

Since this syndrome responds to antibiotic treatment, some authors are using the term antibiotic responsive diarrhea (ARD) (Hall, 2011). Also, a subgroup of dogs with antibiotic responsive diarrhea has been reported that is responsive specifically to tylosin; the term tylosin responsive diarrhea (TRD) has been proposed for this subgroup (Westermarck et al., 2005). Currently, no diagnostic work-up is available that would allow a better definition of these subgroups. It is not clear whether these dogs have the same syndrome or whether subgroups exist that could be classified as small intestinal bacterial overgrowth, small intestinal dysbiosis (SID), tylosin responsive diarrhea or generally as antibiotic responsive diarrhea (ARD). It is important to note that disorders caused by potentially pathogenic bacteria, such as Salmonella spp., Campylobacter spp., enterotoxigenic Clostridium perfringens and C. difficile are not included in this syndrome. Whilst healthy cats appear to have much higher duodenal bacterial counts than healthy dogs, and these numbers do not differ from cats with enteropathies (Johnston et al., 1993), there appears to be a subset of cats with CE that favorably responds to antibiotic administration.

Several physiological mechanisms regulate bacterial colonization in the small intestine. These include secretion of gastric acid and antibacterial factors (i.e. pancreatic and biliary secretions), and intestinal motility. Abnormalities in one or more of these control mechanisms may lead to small intestinal dysbiosis, resulting in clinical signs. As an example, dogs that received gastric acid suppressant therapy with a proton pump inhibitor exhibited alterations in the gastric and small intestinal microbiota (Garcia-Mazcorro et al., 2012).

Pancreatic juice contains antimicrobial substances and dogs with EPI have significantly increased bacterial counts in the small intestine (Westermarck et al., 1993). This is associated with a poor response to pancreatic enzyme replacement therapy. The formation of blind and stagnant small intestinal loops is a common reason for bacterial overgrowth in humans, which may lead to signs of chronic GI disease.

Certain canine breeds, such as the German shepherd and Chinese Shar-Pei, appear to be predisposed to ARE. A genetic susceptibility for a dysregulation in the cell mediated immune response to normal luminal microorganisms is suspected in these dogs. IgA deficiency as an underlying risk factor has not been confirmed. The histopathology in German shepherds and other dogs with antibiotic responsive diarrhea typically is reported as normal to mild lymphocytic-plasmacytic IBD. However, recent studies have reported an abnormal response in innate immunity (altered Toll-like receptor expression) in German shepherds, which may lead to hyper-responsiveness to bacterial flagellin in the small intestine (Kathrani et al., 2012).

It is difficult to diagnose SID/ARD definitively. Duodenal culture is not useful and molecular studies have not been reported. Therefore, it is unclear which bacterial groups are altered. A tentative diagnosis can be made on the basis of clinical signs, altered serum cobalamin and folate concentrations, and by an antibiotic therapeutic trial. However, since diseases due to undetected intestinal pathogens may respond to antibiotic therapy, a positive response to therapy does not necessarily confirm the presence of small intestinal dysbiosis.

Differential diagnoses, such as parasites, bacterial pathogens, maldigestion due to EPI, IBD, intestinal lymphoma, lymphangiectasia and food intolerance should be ruled out.

Histopathological assessment of small intestinal biopsies is often unremarkable. However, occasionally villous atrophy or fusion has been reported. Affected animals also should be evaluated for underlying factors, such as anatomical abnormalities.

 

Serum cobalamin and folate concentrations

Serum cobalamin concentrations may be decreased and serum folate concentrations may be increased in dogs with SID/ARD. Changes in the small intestinal microbiota may lead to increased bacterial utilization of cobalamin, resulting in decreased absorption of cobalamin by the ileum. Bacteria in the distal small and large intestines produce folic acid, but folate absorption via carriers takes place in the proximal small intestine. When folate producing bacteria accumulate in the proximal small intestine, an increased amount of bacterial folate will be absorbed by the host, resulting in an increased serum folate concentration. However, cobalamin and folate uptake from the small intestine is highly complex and can be affected by several mechanisms; therefore, alterations are not highly specific for SID/ARD. A diet high in folate may lead to increased serum folate concentrations independent of disease.

Inflammation of the ileum may damage cobalamin receptors and thus may lead to cobalamin malabsorption. Dogs with EPI have decreased secretion of antibacterial products, with subsequent small intestinal bacterial overgrowth (Simpson et al., 1989). As a consequence, dogs with EPI often have increased serum folate concentrations. Thus, in dogs with an abnormal serum concentration of cobalamin and/or folate, serum trypsin-like immunoreactivity (TLI) should be evaluated to rule out EPI.

Contrary to expectations, administration of tylosin does not lead to a decrease in serum folate or an increase in serum cobalamin concentration (Ruaux et al., 2005). Therefore, serum folate concentrations may not reflect therapeutic success and serum folate concentrations should always be evaluated together with the clinical findings. When both serum cobalamin and folate concentrations are altered, this is suggestive of SID, but both have a relatively low sensitivity and specificity for the diagnosis of SID; the reported sensitivity of serum cobalamin concentration for a diagnosis is 25-55% and for serum folate concentration is 50-66% (German et al., 2003).

 

Conclusions

We are still at an early stage in understanding the complexity of the intestinal microbiota and the metabolic consequences of dysbiosis in GI disease. Recent functional studies have clearly linked dysbiosis with a range of diseases in dogs and cats. However, at this time, not enough clinical data is available to be able make recommendations as to which dysbiosis patterns will respond best to a specific therapy and affected animals need to be treated based on the entire clinical picture. While in some animals the use of antimicrobial agents is useful (e.g. animals with ARD), their use may exacerbate dysbiosis in other GI diseases that do not respond to antibiotics. Therefore, more clinical studies combining results from phylogenetic and functional microbiota analysis are required to better define the various signatures and therapeutic approaches to dysbiosis.

 

Conflict of interest statement

The author is employed by the Gastrointestinal Laboratory at Texas A&M University, which offers gastrointestinal function testing on a fee-for-service base.

 

Figure legend

Fig. 1. Dysbiosis in dogs with idiopathic inflammatory bowel disease (IBD) before and after 3 weeks of therapy. This figure demonstrates how the same data can be illustrated by a heat map and various mathematical algorithms that take into account the bacterial composition within each fecal sample. Fecal DNA is extracted and then the bacterial composition is identified by amplification of 16S rRNA genes, followed by sequencing. Data based on Minamoto et al., (2015). Left top: The data can be displayed using principal coordinate analysis (PCoA) plot, where the data are displayed across the two main principal coordinates (PCoA 1 and 2). Each dot represents the total bacterial community within one sample. The closer the two dots, the more similar is their bacterial community (i.e. they share many bacterial taxa). The more distance between two dots, the more difference there is between the two bacterial communities. Each dot (i.e. sample) is then colored by phenotype, in this case healthy dogs (red), dogs with IBD before therapy (blue) and dogs with IBD 3 weeks after medical therapy (green). The figure on the left illustrates that the healthy dogs cluster more closely together and away from the IBD dogs, indicating differences in the fecal microbiota between healthy dogs and dogs with IBD. Three weeks after therapy and despite improvement in clinical disease activity (CIBDAI score), the microbiota changed only slightly and did not yet cluster closer to the microbiota of healthy dogs. Left bottom: The same data are displayed as an index that summarizes the abundances of major bacterial taxa in each fecal sample as one single numerical value (a positive number indicates dysbiosis). This index can then be used to monitor changes in gut microbiota over time. As in the left figure, the data indicate that, after 3 weeks of therapy, the microbiota has not returned to a state similar to that of healthy dogs. Right: The most abundant bacterial genera of these dogs are displayed as a heat map. Each column represents the bacterial genera in each sample; each row summarizes the abundance of these genera (the more red the higher the abundance). The heat map shows the major abundant genera in healthy dogs are decreased in dogs with IBD.

 

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