Test sierologici per la gestione del COVID-19

https://science.sciencemag.org/content/early/2020/05/14/science.abc1227

 

Test sierologici per la gestione del COVID-19

Florian Krammer 1, Viviana Simon 1,2,3

1. Dipartimento di Microbiologia, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA.

2. Divisione di Malattie Infettive, Dipartimento di Medicina, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, New York, NY, USA.

3. Global Health Emerging Pathogens Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, NY, USA.

Email: florian.krammer@mssm.edu; viviana.simon@mssm.edu

Science 15 maggio 2020: eabc1227 DOI: 10.1126/science.abc1227

Riassunto

La misurazione degli anticorpi contro il SARS-CoV-2 migliorerà la gestione della malattia, se utilizzata correttamente.

Alla fine del 2019, la Cina riportò a Wuhan un gruppo di casi di polmonite atipica, di eziologia sconosciuta.

L’agente causale è stato identificato come un nuovo betacoronavirus, chiamato “sindrome respiratoria acuta grave – coronavirus 2” (SARS-CoV-2), che causa la malattia di coronavirus 2019 (COVID-19) 1.

Il virus si è diffuso rapidamente in tutto il mondo e ha causato una pandemia. Il rapido sequenziamento del genoma virale ha consentito lo sviluppo di test a base di acido nucleico, che sono stati ampiamente utilizzati per la diagnosi di infezioni acute (attuali) SARS-CoV-2 2.

Lo sviluppo di test sierologici, che misurano le risposte anticorpali indotte dall’infezione del SARS-CoV-2 (infezioni passate, ma non attuali), ha richiesto più tempo. Ciò è in parte dovuto alla limitata disponibilità dei sieri di controllo positivi e alla necessità di approfondire i test di specificità e sensibilità, nel contesto dell’immunità preesistente ai coronavirus stagionali. I test sierologici sono importanti per comprendere la prevalenza e l’immunità al SARS-CoV-2.

Negli ultimi decenni, sono stati sviluppati molti tipi di test sierologici, per misurare le risposte anticorpali ai patogeni nei fluidi corporei, in particolare nel siero o nel plasma. Questi saggi utilizzano piattaforme diverse, tra cui i saggi di legame, come i saggi di immuno-assorbimento enzimatico (ELISA), i saggi a flusso laterale o i saggi Western Blot. Inoltre, i test funzionali (che testano la neutralizzazione del virus), l’inibizione degli enzimi o i test battericidi possono fornire informazioni anche sulle risposte immunitarie anticorpali.

Collettivamente, i test sierologici sono strumenti essenziali nella gestione delle malattie infettive, ivi comprese la diagnosi dell’infezione, la misurazione dei titoli di anticorpi protettivi dopo la vaccinazione e le valutazioni di sieroprevalenza dell’immunità in una popolazione.

I test sierologici per il SARS-CoV-2 stanno ora diventando ampiamente disponibili e includono i test ELISA (37), i saggi a flusso laterale (5, 8, 9; vedere la figura) e i test di neutralizzazione del virus. I saggi ELISA e quelli a flusso laterale vengono eseguiti con antigeni ricombinanti, come la proteina del picco (la glicoproteina della superficie principale, utilizzata per attaccare ed entrare nelle cellule) del SARS-CoV-2, il dominio legante il recettore (RBD), che fa parte della proteina del picco, o la nucleoproteina virale.

Si noti che l’uso della nucleoproteina del SARS-CoV-2 induce una maggiore reattività crociata (anticorpi che si legano a più ceppi di coronavirus), rispetto alla proteina del picco, a causa dell’omologia di sequenza della nucleoproteina virale.

Questi saggi possono essere gestiti a livello 2 di bio-sicurezza (e, quindi, possono essere eseguiti più ampiamente), attesa la natura ricombinante degli antigeni selezionati.

Al contrario, i test di neutralizzazione, con SARS-CoV-2 competente per la replicazione, devono essere eseguiti in strutture di livello 3 di bio-sicurezza, il ché limita la loro applicazione. Sono in fase di sviluppo alcune alternative, più sicure e più efficaci, all’utilizzo del virus infettivo, che includono l’uso di saggi di particelle virali pseudotipizzate, in cui la proteina del picco del SARS-CoV-2 viene innestata su virus innocui o su particelle virus-simili.

Recentemente, un numero limitato di saggi ELISA e a flusso laterale ha ricevuto l’autorizzazione all’uso d’emergenza dalla Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti. Inoltre, sono disponibili numerosi saggi a flusso laterale da diverse società, ma la loro utilità è discutibile, data la mancanza di una convalida ufficiale delle prestazioni, rispetto alla sensibilità (ossia, quanti di essi siano rilevati come veri positivi) e alla specificità (la percentuale dei falsi positivi) (911).

L’uso di test sierologici – con sensibilità convalidata e prestazioni di specificità – è fondamentale per ottenere risultati significativi. Per alcune applicazioni, come le indagini sierologiche nelle popolazioni ad alta prevalenza, è accettabile una specificità leggermente inferiore, laddove la sensibilità dovrebbe essere elevata.

Per gli usi in cui un risultato del test falso-positivo sarebbe consequenziale, è essenziale una specificità molto elevata. In generale, sia la sensibilità che la specificità dovrebbero essere le più alte possibili.

Un’importante applicazione dei test sierologici è quella volta a comprendere le risposte anticorpali montate sull’infezione e sulla vaccinazione per il SARS-CoV-2. I saggi che informano sul titolo anticorpale e/o che mostrano la funzionalità anticorpale (ad es., la neutralizzazione del virus) saranno estremamente utili per rispondere a importanti domande scientifiche sulla protezione immunitaria dalla re-infezione. Ad esempio, è vero che tutti gli individui infetti generano una robusta risposta anticorpale all’infezione da SARS-CoV-2?

Non è chiaro se vi sia una differenza nelle risposte anticorpali riscontrate in soggetti che presentano COVID-19 grave, lieve e asintomatica, e in merito a quanto durino le risposte anticorpali.

Inoltre, non è noto se la presenza di anticorpi leganti agli antigeni del picco o del RBD sia correlata alla neutralizzazione del virus. Non è chiaro se i titoli degli anticorpi (leganti o neutralizzanti) siano correlati alla protezione dalla re-infezione. Tali dati saranno importanti, quando si analizzeranno le risposte anticorpali generate dall’infezione naturale, rispetto alla vaccinazione.

I test sierologici possono anche informare in merito alla prevalenza delle infezioni da SARS-CoV-2 in diverse popolazioni. Sebbene non sia pratico testare l’intera popolazione, le indagini sierologiche ben progettate sono essenziali per determinare la prevalenza della COVID-19 nella popolazione generale, in selezionate sottosezioni della popolazione (ad esempio, gli operatori sanitari) o in specifici gruppi a rischio.

Per questi test, è possibile utilizzare sia i saggi quantitativi, sia quelli con esito binario. I saggi quantitativi possono fornire risultati più affidabili [ad esempio, il test ELISA a due fasi (12)], ma sono anche più difficili da ridimensionare, in quanto devono essere spesso eseguiti in laboratori specializzati. Al contrario, i saggi con esiti binari (ad es., i saggi a flusso laterale) possono essere facilmente ridimensionati e implementati, poiché sono spesso test diagnostici veloci, da eseguire nel luogo di cura.

Le analisi dei risultati dei test sierologici devono tenere conto della sensibilità e della specificità del test utilizzato, nonché della prevalenza stimata delle infezioni in una popolazione. Inoltre, sarà necessario prendere in considerazione le variabili biologiche risultanti dalla caratterizzazione approfondita delle risposte immunitarie, tra cui – ma non solo – la durata delle risposte immunitarie e la natura dinamica dei titoli anticorpali collegati a manifestazioni gravi, lievi e asintomatiche di COVID-19, per calcolare la prevalenza sulla base dei test sierologici. Attualmente, molte di queste variabili critiche sono sconosciute, e qualunque analisi dei test sierologici, generata nell’immediato futuro, dovrebbe essere interpretata con cautela.

I donatori per la terapia con plasma dei convalescenti possono essere identificati con i test sierologici.

Il plasma o il siero di individui (o animali) convalescenti, ricchi di anticorpi, sono stati utilizzati per trattare molte infezioni e i morsi di serpente. Uno dei primi esempi è il trattamento della difterite, con antisiero ottenuto dai cavalli, per il quale Emil von Behring ricevette il premio Nobel nel 1901. Più recentemente, l’antisiero è stato utilizzato per il trattamento di una serie di infezioni virali (ad esempio, infezioni da virus Hantaan, Virus Junin, virus del morbillo ed ebolavirus, nonché potenziali infezioni da rabbia).

Gli individui, che si riprendono dalla COVID-19, sviluppano anticorpi contro il SARS-CoV-2. Durante le fasi iniziali dell’epidemia di COVID-19 in Cina, la terapia al plasma dei convalescenti è stata usata in modo compassionevole (13) e, da allora, è stata implementata negli Stati Uniti e altrove. Probabilmente, il successo di questo intervento aumenta col titolo anticorpale del donatore. È quindi importante selezionare i potenziali donatori convalescenti, in modo da poter selezionare i soggetti coi più alti titoli di anticorpi.

Questo screening può essere realizzato misurando l’attività di neutralizzazione del virus svolta dal plasma, che è un processo lungo (diversi giorni) e che deve essere eseguito in un laboratorio di livello 3 di bio-sicurezza. Il test sugli anticorpi, basato sul test ELISA, che produce un titolo, è rapido (in ore) e facile da eseguire. È stato dimostrato che le misurazioni quantitative dei titoli anticorpali di almeno due diversi test ELISA si correlano bene con i titoli neutralizzanti (3, 4).

Identificare i soggetti immuni è un’applicazione importante, ma anche complessa e politicamente ‘caricata’, dei test sierologici. Gli individui, che sono stati infettati dai coronavirus umani della “comune influenza”, sviluppano risposte anticorpali e sono protetti dalla re-infezione per un certo periodo di tempo, probabilmente per anni (14). Se si verifica una re-infezione, questa è spesso lieve o asintomatica.

Inoltre, è stato dimostrato che l’infezione da SARS-CoV-1 induce risposte anticorpali neutralizzanti, che durano per diversi anni (14).

Sulla base di questi dati, si presume che le persone con anticorpi anti-SARS-CoV-2 siano meno suscettibili alla re-infezione, riducendo il rischio di contrarre gravi COVID-19 e limitando anche la possibilità di diffusione del virus. Pertanto, è stato proposto che gli individui con solide risposte anticorpali potrebbero tranquillamente tornare alla vita e al lavoro normali, avviando lentamente il sistema su un percorso di ripresa.

Anche il rilevamento di risposte immunitarie protettive è importante, per gli operatori sanitari. Inoltre, le persone immuni al SARS-CoV-2 potrebbero essere risparmiate dalle misure di quarantena e di distanziamento sociale, durante un’eventuale seconda o terza ondata di infezioni di SARS-CoV-2 nell’inverno del 2020. Di conseguenza, alcuni Paesi hanno proposto un “passaporto immunitario” per tali soggetti.

Tuttavia, vi sono numerosi avvertimenti che dovrebbero essere attentamente considerati, prima di procedere. Deve essere dimostrato che gli individui, che hanno sviluppato anticorpi contro il SARS-CoV-2, sono protetti. Se gli anticorpi forniscono immunità e protezione, non è (ancora) noto per quanto tempo questi persisteranno al titolo necessario. Una persona, oggi protetta, potrebbe non essere più protetta tra 6 mesi. È quindi necessario condurre studi volti a sezionare l’entità, la durata e la funzionalità delle risposte immunitarie indotte dall’infezione del SARS-CoV-2, che comprendano gli anticorpi, nonché le risposte immunitarie (adattative) cellulari, e determinare la correlazione tra risposta immunitaria e protezione.

In mancanza di questa conoscenza, le decisioni sulla distribuzione della forza-lavoro potrebbero basarsi su informazioni incomplete ed essere guidate da ipotesi errate.

Un titolo anticorpale noto, correlato alla protezione, sarebbe anche estremamente utile per lo sviluppo di un vaccino. Titoli protettivi e/o correlati della protezione immunitaria sono stati stabiliti per molte infezioni virali, tra cui il virus dell’influenza, quello dell’epatite A, dell’epatite B e del morbillo. Per molte di queste infezioni, la dinamica delle risposte immunitarie è ben compresa e la durata della protezione basata sui titoli anticorpali è stata modellata con successo (15). Per questi tipi di studi, i test sierologici – che misurano un titolo quantitativo di anticorpi – sono stati strumentali.

Tuttavia, quando si converte il concetto di “passaporto immunitario” nella pratica, possono anche essere utili saggi sierologici veloci, da eseguire nel luogo di cura, che producono una risposta binaria. Un approccio strategico combinato può essere quello più sicuro, se praticabile.

Per tenere conto della sensibilità e dei falsi-positivi, se ogni risultato positivo del test a flusso laterale viene confermato con un secondo test, che produce un titolo – che indica anche la solidità della risposta e che potrebbe essere collegato alla presenza e alla durata della protezione, il numero di risultati falsi-positivi sarebbe notevolmente ridotto. Un tale approccio sequenziale mirato fornirebbe informazioni affidabili sull’immunità, ed eviterebbe di mettere a rischio le persone.

Numerosi laboratori accademici hanno sviluppato saggi sierologici robusti e specifici, e stanno diventando disponibili delle opzioni commerciali di alta qualità. In conformità con le tradizioni accademiche di base, è stato distribuito un kit di strumenti per istituire test sugli anticorpi in oltre 200 laboratori in tutto il mondo, ed è stato pubblicato un dettagliato protocollo per facilitare l’implementazione locale (12).

Con le analisi sierologiche di alta qualità, ora disponibili, la sfida-chiave sarà quella di applicare e distribuire in modo strategico questi test, per riportare le comunità in sicurezza, fuori dall’attuale risposta pandemica, al regno della vita “normale”.

 

Letture quantitative e binarie nei test sierologici.

I test sierologici quantitativi e binari possono fornire importanti informazioni sull’infezione.

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Riferimenti e note

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Ringraziamenti: grazie ai colleghi e ai membri di laboratorio, che hanno lavorato senza sosta per aiutare a controllare questa pandemia. Gli autori sono supportati dai Centri Collaborativi per l’Innovazione dei Vaccini per l’Influenza (CIVIC; 75N93019C00051) presso l’Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive (NIAID), dai Centri di Eccellenza NIAID per la Ricerca e la Sorveglianza dell’Influenza (CEIRS; HHSN272201400008C), dai finanziamenti istituzionali e dalle donazioni filantropiche. I reagenti del SARS-CoV-2, sviluppati nei nostri laboratori, sono disponibili gratuitamente per la comunità scientifica (www.beiresources.org/). Il Mount Sinai è in procinto di ottenere licenze commerciali per i test qui descritti e ha presentato domanda di brevetto.

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