Uno studio molecolare retrospettivo su protozoi intestinali selezionati in gatti sani, in italia

533549 JFM0010.1177/1098612X14533549
Journal of Feline Medicine and Surgery
Mancianti et al research-article 2014

 

Breve Comunicazione

 

 

UNO STUDIO MOLECOLARE RETROSPETTIVO SU PROTOZOI INTESTINALI SELEZIONATI IN GATTI SANI, IN ITALIA

 

Francesca Mancianti, Simona Nardoni, Linda Mugnaini, Lucia Zambernardi, Alessandro Guerrini, Valentina Gazzola e Roberto Amerigo Papini

 

Journal of Feline Medicine and Surgery

2015, Vol. 17(2) 163–­167

© ISFM and AAFP 2014 Reprints and permissions:

sagepub.co.uk/journalsPermissions.nav DOI: 10.1177/1098612X14533549 jfms.com

Università di Pisa, Italia

 

Autore corrispondente:

Francesca Mancianti DVM, PhD, Università di Pisa, Viale delle Piagge 2, Pisa, 56100, Italia

Email: manciant@vet.unipi.it

 

Scaricato da jfm.sagepub.com all’Università degli Studi di Torino il 9 Ottobre, 2015

 

Riassunto

L’intestino felino può ospitare un certo numero di parassiti protozoi. Recenti studi genetici hanno evidenziato nuovi risultati epidemiologici su specie di Cryptosporidium, assemblaggi di Giardia duodenalis e di Toxoplasma gondii. Inoltre, studi epidemiologici suggeriscono che la presenza di Tritrichomonas foetus nei gatti è in aumento in tutto il mondo.

La prevalenza dei protozoi intestinali selezionati è stata determinata mediante PCR, utilizzando il DNA precedentemente estratto dalle feci di 146 gatti sani di proprietà privata, dall’Italia. È stata raggiunta la genotipizzazione molecolare sul DNA del T. gondii, della G. duodenalis e del Cryptosporidium. I saggi PCR sono stati positivi per 32 campioni (22,9%). Tre animali (2,0%) sono risultati positivi per il DNA del T. foetus e del Cryptosporidium, 15 campioni (10,3%) erano positivi per il T. gondii, ed 11 (7,5%) per la G. duodenalis.

Non sono mai state osservate co-infezioni.

I risultati dell’analisi di digitazione hanno permesso l’identificazione di Cryptosporidium felis in tutti i casi. I campioni positivi per il T. gondii accennavano un genotipo I clonale (n=7), un genotipo II (n=1) ed un genotipo III (n=7).

Gli isolati della G. duodenalis erano riferibili ad assemblaggi F (n=9) e C (n=2).

In conclusione, i risultati ottenuti in questo studio si aggiungono alla letteratura riguardante l’epidemiologia di questi parassiti, con la conferma della loro presenza nelle feci di gatti sani.

 

Accettato: 7 Aprile 2014

 

Il Toxoplasma gondii rappresenta un rischio per la salute pubblica.

I gatti sono gli unici felini domestici che diffondono gli oocisti del T. gondii, con una prevalenza di 0,1 – 0,4% nei Paesi europei 1-13.

In Nord America e in Europa, sono state descritte prevalentemente tre linee clonali del T. gondii (designate come tipi clonali I, II e III), come analizzate dalla reazione a catena della polimerasi per polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione (PCR-RFLP), e dalla copiatura dei microsatelliti 14,15.

I genotipi atipici geneticamente differenti sono stati descritti come prevalenti in Sud America ed in Asia 16.

I genotipi felini del T. gondii non sono mai stati descritti in Italia.

Il genus del Cryptosporidium, attualmente, contiene almeno 20 specie valide ed oltre 40 genotipi, con diversi livelli di adattamento all’ospite animale 17.

Un’infezione felina è segnalata in tutto il mondo, ed è dimostrato che essa è causata dal Cryptosporidium felis felino-specifico. Il Cryptosporidium parvum ed il Cryptosporidium muris sono stati riscontrati occasionalmente in gatti naturalmente infetti, probabilmente a causa delle gamme di queste specie più ampie, per l’ospite.

Gli studi pubblicati su questa infezione nei gatti, in Europa, danno tassi di prevalenza che vanno dallo 0% al 24,5% 18,19. Lo stato di salute degli animali esaminati (normali o diarroici), le diverse fasce di età e le tecniche diagnostiche utilizzate contribuiscono, probabilmente, alle variazioni dei tassi di infezione in studi diversi.

La Giardia duodenalis è geneticamente composta da assemblaggi chiamati A-G.

Tutti gli assemblaggi A-F sono stati rilevati nei gatti, in uno studio multinazionale 20, anche se l’assemblaggio A e l’assemblaggio F (specifico per gatti) erano quelli dominanti.

Questa scoperta è stata anche confermata da altri studi 21,22. La prevalenza generale dell’infezione da Giardia nei gatti Europei varia dal 4,4% al 37,0% 18,23.

Lo scopo di questo studio retrospettivo era quello di determinare la prevalenza di protozoi intestinali selezionati mediante PCR, utilizzando il DNA precedentemente estratto dalle feci di gatti sani di proprietà privata, in Italia.

Considerando la bassa quantità di informazioni riportate da questo Paese, l’ulteriore genotipizzazione molecolare è stata ottenuta utilizzando il DNA del T. gondii, della G. duodenalis e del Cryptosporidium, al fine di aggiungere le informazioni disponibili sui tipi che si verificano nei gatti sani.

146 campioni di feci sono stati raccolti da gatti che vivono in Toscana (province di Pisa e Firenze) e Liguria (provincia di Genova), subito dopo la defecazione. Tutti i campioni sono stati ottenuti da gatti europei sani a pelo corto, di proprietà privata, appartenenti a entrambi i sessi, e di età compresa tra 1 e 3 anni, sottoposti a castrazione in cliniche veterinarie private.

I campioni erano stati precedentemente raccolti per un’indagine epidemiologica, al fine di accertare la presenza del T. gondii in gatti adulti sani. I criteri di inclusione erano quelli per cui gli animali erano autorizzati a muoversi all’aria aperta, non avevano avuto diarrea nei 3 mesi precedenti e non avevano ricevuto alcun farmaco negli ultimi 30 giorni.

I campioni fecali sono stati mantenuti a 4° C, e poi sottoposti ad esame copromicroscopico ed all’estrazione del DNA entro 24 ore dal prelievo. I campioni sono stati divisi in due aliquote; quella da 0,04 g è stata elaborata da un metodo di flottazione convenzionale, utilizzando 262 mg/ml di ZnCl2 e 275 mg/ml di NaCl, come descritto da Schares et al. 24 .

L’esame copromicroscopico è stato effettuato con un ingrandimento ×400.

Il DNA fecale è stato estratto dai campioni, utilizzando un DNA Miniprep kit fecale di ZR (Zymo Research).

Tutti i primer e gli enzimi di restrizione sono stati forniti da Eurofins MGW (M-Medical).

Il DNA del Tritrichomonas foetus è stato rilevato mediante una PCR nidificata a tubo singolo, che ha amplificato la regione (ITS1 e ITS2) del distanziatore interno trascritto (ITS) del T. foetus, ed il gene rRNA 5.8S, come descritto da Gookin et al. 25.

La PCR nidificata (nPCR) per il DNA del T. gondii è stata eseguita secondo la procedura riportata da Jones et al. 26, utilizzando due coppie di primer degli oligonucleotidi per amplificare le regioni del gene B1. I genotipi sono stati determinati tramite multi-plex multilocus PCR-RFLP per 12 marcatori genetici (SAG1, 3′-SAG2, 5′-SAG2 alt.SAG2, SAG3, BTUB, GRA6, C22-8, C29-2, L358, PK1 e Apico) 27.

La G. duodenalis è stata rilevata amplificando il gene del glutammato-deidrogenasi (gdh), e la genotipizzazione è stata effettuata mediante PCR-RFLP, utilizzando gli enzimi di restrizione NlaIV e RsaI 28.

Il DNA della specie di Cryptosporidium è stato rilevato con una nPCR, che ha amplificato il locus del gene rRNA della piccola subunità 18s; la genotipizzazione con PCR-RFLP è stata effettuata con gli enzimi di restrizione SspI e VspI 29.

Inoltre, per confermare i risultati ottenuti con la PCR-RFLP, i prodotti della PCR delle specie di T. foetus, G. duodenalis e Cryptosporidium sono stati purificati utilizzando un kit di purificazione QIAquick PCR (Qiagen), secondo le istruzioni del fabbricante, e quindi sequenziati.

Tutte le procedure di sequenziamento sono state eseguite da un laboratorio commerciale (BMR-Genomics, Padova, Italia). Le sequenze sono state assemblate e corrette mediante analisi visiva dell’elettroferogramma, utilizzando un Bioedit v.7.0.2 30, e poi confrontate con quelle disponibili in GenBank, utilizzando il programma BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

L’esame copromicroscopico era negativo per il T. gondii, nonché per le cisti di Giardia, in tutti i campioni esaminati.

I saggi PCR sono stati positivi per 32 feci feline (22,9%). Tre animali (2,0%) sono risultati positivi per il DNA del T. foetus e del Cryptosporidium, 15 campioni (10,3%) sono risultati positivi per il T. gondii, ed 11 (7,5%) per la G. duodenalis. Non sono state riportate co-infezioni.

I risultati dell’analisi di tipizzazione hanno permesso di individuare il C. felis in tutti i casi. I campioni positivi per il T. gondii non sono stati pienamente genotipizzati in tutti i 12 loci, ma sono stati ottenuti suggerimenti per i genotipi clonali I (n=7), II (n=1) e III (n=7). Risultati più dettagliati sono riportati nella Tabella 1.

Sono stati rilevati assemblaggi F (n=9) e C (n=2) della G. duodenalis.

La prevalenza registrata per il T. foetus è stata del 2%, in pieno accordo con Xenoulis et al 12. In altre analisi molecolari sui gatti, i soggetti positivi avevano la diarrea 6,31.  Questo parassita è considerato significativamente associato alla diarrea, anche se un recente rapporto 32 ha suggerito la possibilità di isolare questo agente da gatti clinicamente normali, il che è in accordo con i risultati ottenuti da noi.

Quindici gatti erano positivi per il DNA del T. gondii, con una prevalenza globale del 10,3%. Questo risultato è in accordo con una precedente relazione effettuata su gatti randagi delle colonie della Toscana 33.

I nostri risultati non possono essere confrontati con qualsiasi altro studio simile. I dati della letteratura europea si riferiscono alla PCR effettuata su oocisti rivelate dalla copromicroscopia. Il tipo clonale II, con l’allele I Apico, era il genotipo più ricorrente in Germania ed in Svizzera 13,34. Inoltre, in Germania, sono stati trovati un genotipo clonale III e 10 genotipi misti 34.

Questi risultati non concordano completamente con i risultati del nostro studio: in questo studio sono stati identificati tutti i genotipi apparentemente clonali e non mescolati, ed i genotipi indicativi di I e III erano quelli prevalenti.

Per quanto a nostra conoscenza, questo è il primo rapporto sulla genotipizzazione del DNA del T. gondii da feci feline in Italia. La genotipizzazione è stata precedentemente effettuata in Italia sul DNA del T. gondii per animali domestici e selvatici, ed indicava la presenza di genotipi strettamente clonali nelle capre 35 e nei gatti, e di tipi misti rilevati in uccelli acquatici ruspanti 36 e nelle volpi 37. Questi risultati sono in accordo con l’ipotesi di due cicli distinti di T. gondii in ambienti domestici e selvatici 38.

Undici gatti erano positivi per il DNA della G. duodenalis, con una prevalenza globale del 7,5%, il che è in accordo con Paoletti et al 18.

La genotipizzazione ha prodotto nove assemblaggi, di cui quello F era il più frequente nei gatti, e quello C era il più comune nei cani. Il recupero degli assemblaggi canini nelle feci di gatto è stato riportato in precedenza 39,40, e potrebbe essere dovuto alla presenza di cisti di Giardia su peli felini che vengono ingeriti durante la toelettatura.

Questi assemblaggi non sono mai stati ritrovati negli esseri umani degli USA con infezione da G. duodenalis 39; anche se in uno studio è stato riportato l’assemblaggio F negli esseri umani, questo reperto deve ancora essere confermato in loci aggiuntivi 41.

Quella del C. felis è stata l’unica specie di Cryptosporidium isolata in questo studio; è stata isolata da tre gatti, con una prevalenza del 2%. Nonostante la strettissima associazione tra esseri umani e gatti, le infezioni da C. felis vengono raramente registrate nell’uomo 42.

 

Conclusioni

I risultati ottenuti nel nostro studio si aggiungono alle informazioni disponibili sull’epidemiologia di questi parassiti, e confermano la loro presenza nelle feci dei gatti sani.

Molti gatti condividono gli stessi nuclei familiari, come mostrato in un questionario svolto negli USA 43. Dato il gran numero di nuclei familiari con molti gatti, è di fondamentale importanza la comprensione e la prevenzione delle malattie che possono trasmettersi i gatti tra di loro. I protozoi parassiti intestinali, tra cui il T. gondii, il T. foetus, il C. felis e la G. duodenalis, possono causare infezioni insidiose, con i gatti asintomatici che sono in grado di trasmettere la toxoplasmosi, la tricomoniasi, la criptosporidiosi e la giardiasi ad altri gatti.

Queste infezioni possono essere importanti fonti di malattia nelle popolazioni feline.

I gatti sani sono protetti da un sistema immunitario efficace, e sostenuti da buone condizioni nutrizionali, sanitarie ed igieniche. I gatti immunocompromessi, compresi gli animali con nutrizione carente, col virus dell’immunodeficienza felina e/o con l’infezione da virus della leucemia felina, con malattie sistemiche e croniche, con concomitante somministrazione di farmaci immunosoppressori e con stress ambientale, hanno un rischio molto più elevato di sviluppare queste malattie da protozoi.

La consapevolezza delle infezioni “non-apparenti” nelle popolazioni feline sane può essere importante per evitare l’esposizione a questi agenti, e per diminuire in tal modo la probabilità di trasmissione ai gatti che hanno una funzione immunitaria compromessa.

 

Ringraziamenti. Desideriamo ringraziare la dott.ssa Nadia Ferrini per il suo eccellente montaggio del testo.

 

Conflitto di interessi. Gli autori non hanno alcun potenziale conflitto di interessi da dichiarare.

 

Finanziamento. Gli autori non hanno ricevuto specifica sovvenzione da alcuna agenzia di finanziamento del settore pubblico, commerciale o no-profit, per la preparazione di questa breve comunicazione.

 

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